使用靶向核酸酶调节微生物群的组成制造技术

本文提供了用于重塑复杂的微生物群体的组合物和方法。RNA引导的核酸酶系统被改造为靶向所靶向的原核生物的染色体DNA中的位点，其中可以在混合的原核生物群体中调节所靶向的原核生物的水平。的原核生物的水平。的原核生物的水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用靶向核酸酶调节微生物群的组成
[0001]相关申请本申请要求于2019年9月30日提交的美国临时申请号62/908,130、以及于2019年10月1日提交的美国临时申请号62/909,078、以及于2020年7月16日提交的美国临时申请号63/052,825的优先权权益，所述美国临时申请各自的整体内容通过引用并入本文。
[0002]序列表本申请包含序列表，所述序列表已经由EFS
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Web以ASCII格式提交，并且在此通过引用以其整体并入。于2020年9月29日创建的ASCII副本命名为P19
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171_WO
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PCT_SL.txt且大小为51,634字节。


[0003]本公开内容涉及用于重塑微生物群的组成的组合物和方法。

技术介绍

[0004]控制微生物群体的组成和表达的功能是医学、生物技术和环境循环的关键方面。虽然经典的抗微生物策略提供了一些控制，但仍然难以捉摸的是通用且可编程的策略，其可以区分甚至密切相关的微生物，并且允许对微生物群体的组成的精细控制。最近的进展指示了，可以设计RNA引导的核酸酶系统以靶向微生物群体中的特定DNA序列。采用类似的策略从多物种细菌群体中靶向且去除特定物种将是有益的。
附图说明
[0005]专利或申请文件含有至少一幅彩色绘图。本专利或专利申请公开的带有彩色附图的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
[0006]图1A
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1B示出了使用整合的、诱导型CRISPR系统的靶向微生物群调节。CRISPR系统(Cas9核酸内切酶和引导RNA)的表达导致细菌中的染色体断裂以及最终的细胞死亡。因此，在脱水四环素(aTc)诱导后，可以从混合群体中原位消除包含具有靶向引导RNA的整合CRISPR盒的特定拟杆菌属菌株。
[0007]图2呈现了CRISPR整合载体的示意图。Cas9蛋白由脱水四环素(aTc)诱导型启动子表达。单引导RNA (N20
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sgRNA支架)由P1启动子组成型表达，其中20个核苷酸的前间隔序列(N20)指定当存在PAM (在化脓链球菌(Streptococcus pyogenes) CRISPR/Cas9的情况下，NGG)时，基因组中的靶向DNA切割。
[0008]图3A
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3C示出了CRISPR系统在人肠道衍生的细菌多形拟杆菌(Bt)中的染色体整合。图3A图解了NBU2整合机制。图3B显示了CRISPR经由接合与Bt的整合。图3C呈现了CRISPR整合体的菌落PCR筛选。PCR A：attBT2
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1基因座，外部引物；PCR B：attBT2
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2基因座，外部引物；PCR C：attBT2
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1基因座，左连接点；PCR D：attBT2
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2基因座，左连接点。M1
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M4：具有非靶向、对照gRNA的四个Bt菌落；T1
–
T4：具有tdk靶向gRNA的四个Bt菌落；S1
–
S4：具有susC靶向gRNA的四个Bt菌落。
[0009]图4A
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4B示出了使用整合的CRISPR系统，各个拟杆菌属菌株的诱导的CRISPR杀死。图4A呈现了在血琼脂平板上的结果。对于选择的CRISPR整合体(M1和T1)，将TYG + Gm 200、Em25中的管培养物稀释，并且涂抹(24小时管培养物、10
‑
6稀释、100μl涂抹)在BHI血琼脂平板(Gm 200、Em 25)上，所述BHI血琼脂平板分别补充有浓度为0和100 ng/ml的脱水四环素(aTc)。细胞在37
°
C下厌氧温育40小时。图4B显示了在TYG液体培养基中的结果。选择的CRISPR整合体(M1、M2、T1、T3、S1、S2)在TYG培养基中在37
°
C下从新鲜菌落厌氧生长6小时至OD
600nm ~0.6，1:100稀释至分别补充有终浓度为0、10和100 ng/ml的aTc的新鲜TYG液体培养基(Gm 200、Em 25)。在37
°
C下在厌氧条件下培养24小时的过程中评价生长。
[0010]图5A
‑
5C呈现了在体外混合群体中的特定拟杆菌属菌株的靶向诱导性CRISPR杀死。选择的CRISPR整合体(M1、T1、S1)在TYG培养基中在37℃下从新鲜菌落厌氧生长6小时至OD
600nm ~0.6。将等体积的细胞培养物(1:100稀释度)混合，并且加入新鲜的TYG液体培养基(Gm 200、Em 25)中，所述TYG液体培养基分别补充有终浓度为0、10和100 ng/ml的aTc。这些培养物在37℃下厌氧温育24小时。图5A：OD
600nm
测量。图5B：对于用浓度为100 ng/ml、10 ng/ml和0 ng/ml的aTc处理的培养物，执行扩增引导RNA区域的PCR (与Cas9和NBU2编码序列结合的引物，1.5 kb的扩增子大小)，随后为桑格DNA测序。用aTc处理的培养物仅具有非靶向对照gRNA。图5C：将M1+S1_aTc100的培养物稀释(10
‑6)，并且涂抹到BHI血琼脂平板(Gm 200、Em 25)上，并且在37℃下厌氧温育40小时，以获得单个菌落。对于5个选择的单个菌落和来自琼脂平板的刮取混合物执行扩增引导RNA区域的菌落PCR，随后为桑格DNA测序，显示了所有生长的克隆仅包含非靶向、对照gRNA。
[0011]图6示出了在普通拟杆菌(Bv)的染色体上的CRISPR整合。挑选来自每次接合的菌落Bv.M (标记为VM1、VM2、VM3、VM4、VM5、VM6和VM7)和susC_Bv (标记为V1、V2、V3、V4、V5)，用于菌落PCR筛选。0，Bv野生型菌株；M，DNA梯。PCR A (外部引物，0.5或0 kb)用于筛选在attBv.3
‑
1基因座的整合；PCR B (外部引物，0.5或0 kb)用于筛选在attBv.3
‑
2基因座的整合，并且PCR C (外部引物，0.6或0 kb)用于筛选在attBv.3
‑
3基因座的整合。PCR D (与ermG编码序列结合的外部引物和内部引物，0.6或0 kb：attBv.3
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1基因座整合的左连接点)用于确认所选克隆的整合染色体和整合质粒序列的连接。左图：具有非靶向、对照引导RNA (M)的整合菌株；右图：具有靶向susC_Bv引导RNA的整合菌株。
[0012]图7A
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7C示出了多形拟杆菌CRISPR
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突变体生长的表征。图7A：用于改造多形拟杆菌VPI
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5482 CRISPR突变体的质粒设计。图7B：在血琼脂平板
±ꢀ
200 ng/mL aTc上培养的Bt突变体，其含有乱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种蛋白质
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核酸复合物，其包含与细菌或古细菌物种的染色体缔合的改造的RNA引导的核酸酶系统，其中所述改造的RNA引导的核酸酶系统靶向微生物的染色体中的位点，并且所述微生物的染色体编码HU家族DNA结合蛋白，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少50%序列同一性的氨基酸序列。2.权利要求1的蛋白质
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核酸复合物，其中所述改造的RNA引导的核酸酶系统是选自I型CRISPR系统、II型CRISPR系统、III型CRISPR系统、IV型CRISPR系统、V型CRISPR系统或VI型CRISPR系统的CRISPR系统。3.权利要求2的蛋白质
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核酸复合物，其中所述CRISPR系统包含CRISPR核酸酶和引导RNA。4.权利要求3的蛋白质
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核酸复合物，其中所述CRISPR核酸酶是Cas9、Cas12、Cas13或CasX。5.权利要求1至4中任一项的蛋白质
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核酸复合物，其中所述改造的RNA引导的核酸酶系统由核酸表达，所述核酸编码改造的RNA引导的核酸酶系统，并且整合到细菌或古细菌染色体内。6.权利要求1至4中任一项的蛋白质
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核酸复合物，其中所述改造的RNA引导的核酸酶系统由核酸表达，所述核酸编码改造的RNA引导的核酸酶系统，并且在染色体外载体上携带。7.权利要求1至6中任一项的蛋白质
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核酸复合物，其中所述原核染色体在拟杆菌属(Bacteroides)物种内。8.权利要求7的蛋白质
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核酸复合物，其中所述拟杆菌属物种选自多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、解纤维素拟杆菌(B.cellulosilyticus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、溃疡拟杆菌(B. helcogenes)、卵形拟杆菌(B. ovatus)、萨氏拟杆菌(B. salanitronis)、单形拟杆菌(B. uniformis)或解木糖拟杆菌(B. xylanisolvens)。9.一种用于减缓混合的原核生物群体中的靶原核生物生长的方法，所述方法包括在靶原核生物中表达改造的RNA引导的核酸酶系统，其中所述改造的RNA引导的核酸酶系统靶向靶原核生物的染色体中的位点，使得将至少一个双链断裂引入靶原核生物的染色体中，从而减缓所述靶原核生物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：