一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球技术

本发明专利技术公开了一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球，属于蛋白制备领域。融合碳端的重组蛛丝蛋白由8个重复核心序列和碳端序列组成，重组蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。为了实现重组蛛丝蛋白的简易表达，本发明专利技术将该重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT克隆在载体pCold I上，实现了无需克隆甘氨酸

【技术实现步骤摘要】
一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球


[0001]本专利技术属于蛋白制备
，具体涉及一种重组蛛丝蛋白，特别是涉及一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球。

技术介绍

[0002]蜘蛛种类繁多，达4万多种，广泛分布于世界各地。不同种类的蜘蛛分泌不同数量和种类的蛋白，有的种类的蜘蛛可产生多种蛋白质，如主壶腺蛛丝蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)和次壶腺蛛丝蛋白(minor ampullate spidroin,MiSp)等。主壶腺蛛丝蛋白MaSp由两部分组成：MaSp1和MaSp2。蛛丝蛋白的肽链在组成和结构上存在共有的特征，即都有重复的GGX(甘氨酸区)、聚(A)/聚(GA)(聚丙氨酸)区、间隔区和非重复碳端和氮端，氮端的作用是抑制蛛丝蛋白溶液在未纺丝之前凝聚，而碳端的作用是影响蛛丝的存储状态和组装状态的切换，控制蛋白在离子溶液中的溶解性和纤维成形性，促进β
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折叠的形成，进而影响蛋白的二级结构影响蛋白的纤维结构，因此碳端对蛋白的性能影响较大。目前的研究报道最多可表达MaSp1的4个重复序列融合碳端的蛋白，不能表达更多重复核心序列的蛋白。
[0003]蛛丝蛋白因其序列中含有多重复的GGX(甘氨酸区)和GPGXX(脯氨酸区)，多重复的重组蛛丝蛋白的表达非常依赖于宿主合成转运RNA的数量，因此在表达时对氨基酸G(甘氨酸)及其对应的tRNA(转运RNA)需求大量极大，但宿主合成甘氨酸和tRNA的资源有限，故而大大限制了目的蛋白在宿主中的表达，导致其表达量较低甚至不表达。文献显示在pET系列载体如pET28、pET32等能成功表达多重复核心序列的通用手段是：在克隆阶段引入可翻译甘氨酸
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tRNA的序列，同时降低诱导温度和转速，让蛋白缓慢地表达。但其构建复杂，需要在多个载体中多次操作。同时，翻译转运tRNA会消耗培养基中的营养，导致诱导表达体积大，纯化难度大。此外，多重复的重组蛛丝蛋白的诱导表达依赖于甘氨酸
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tRNA，因此，需要寻找一种能够简易表达的重组蛛丝蛋白。

技术实现思路

[0004]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球，解决现有重组蛛丝蛋白诱导表达复杂的问题。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0006]本专利技术公开了一种融合碳端的重组蛛丝蛋白，所述融合碳端的重组蛛丝蛋白由一个碳端序列和一个或多个核心序列组成，所述核心序列如SEQ.ID.NO.1所示，碳端序列如SEQ.ID.NO.2所示。
[0007]优选地，所述融合碳端的重组蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，由8个重复核心序列和1个碳端序列组成，编码所述融合碳端的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列如
SEQ.ID.NO.3所示。
[0008]本专利技术还公开了上述一种融合碳端的重组蛛丝蛋白的制备方法，具体步骤如下：对pET载体上的核心序列通过酶切和连接，将含有一个碳端序列的片段和含有一个或多个核心序列的片段连接并转移至pCold I上，孵育、转化、诱导表达并纯化，制得融合碳端的重组蛛丝蛋白；
[0009]其中，当核心序列为多个时，需要对核心序列进行核心序列倍增处理。
[0010]优选地，转移时在pET载体和pCold I的共同限制性内切酶的酶切位点进行酶切。
[0011]优选地，所述纯化包括粗分离和柱纯化，粗分离包括超声、离心和热变性步骤。
[0012]进一步优选地，热变性的温度为30℃
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60℃，时间为30min。
[0013]进一步优选地，热变性的温度为40℃或50℃，热变性后的离心力为20000g。
[0014]本专利技术还公开了上述一种融合碳端的重组蛛丝蛋白在制备生物材料中的应用。
[0015]本专利技术还公开了一种载药微球，所述载药微球由上述融合碳端的重组蛛丝蛋白溶于磷酸钾缓冲液中制得。
[0016]优选地，所述磷酸钾缓冲液的pH值为7。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0018]本专利技术提供的一种融合碳端的重组蛛丝蛋白，由重复核心序列和碳端序列组成，通过碳端序列的作用能够影响蛛丝的存储状态和组装状态的切换，控制蛋白在离子溶液中的溶解性和纤维成形性，促进β
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折叠的形成，影响蛋白的二级结构，进而影响蛋白的纤维结构，多个重复核心序列相比于现有的重组蛛丝蛋白，表达更多的重复核心序列能够使表达更简易。该重组蛛丝蛋白能够应用于生物材料制备领域，具有很好的应用前景。
[0019]本专利技术提供的一种融合碳端的重组蛛丝蛋白的制备方法，不同于现有技术中的在pET系列载体上，引入可翻译甘氨酸
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tRNA的序列，同时降低诱导温度和转速，让蛋白缓慢地表达的复杂方法，本方法将重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT克隆在载体上，再将MaSp2(8R)+CT片段转移至pCold I上，孵育、转化、诱导表达并纯化，制得融合碳端的重组蛛丝蛋白，通过将目的片段转移至pCold I上，解决了现有蛋白制备过程中需要多个载体中多次操作、翻译需要转运tRNA，依赖于甘氨酸
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tRNA或甘氨酸/丙氨酰—tRNA的问题，能够实现无需克隆甘氨酸
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tRNA的编码序列就成功诱导表达重组蛛丝蛋白，该制备方法简单易操作，制得的蛋白含量高。
[0020]本专利技术提供的一种载药微球，相比于现有的载药微球，毒性更小，载药率可达75％，高于现有技术的40％
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60％，释放率中，能够释放加载药物的83％，高于现有技术的60％，载药率和释放率更高，同时，该载药微球的制备方法简单，应用前景广阔。
附图说明
[0021]图1为本专利技术的载体pCold I构建融合碳端的重组蛛丝蛋白的电泳图；其中，图A为pColdⅠ的双酶切电泳图(从左到右依次为1kb plus(marker)、pCold I和pCold I
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NdeⅠ+HindⅢ)，图B是pColdⅠ的双酶切和单酶切产物对比图(从左到右依次为1kb plus(marker)、pCold I
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HindⅢ和pCold I
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NdeⅠ+HindⅢ)，图C是MaSp2(8R)+CT双酶切电泳图(从左到右依次为marker、MaSp2(8R)
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NdeⅠ+HindⅢ和MaSp2(8R)+CT
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NdeⅠ)，图D为MaSp2(8R)+CT双酶切回收电泳图(依次是1kb plus(marker)、MaSp2(8R)+CT
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NdeⅠ+HindⅢ(1343/5304)和MaSp2
(8R)+CT
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NdeⅠ+HindⅢ)；
[0022]图2为本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合碳端的重组蛛丝蛋白，其特征在于，所述融合碳端的重组蛛丝蛋白由一个碳端序列和一个或多个核心序列组成，所述核心序列如SEQ.ID.NO.1所示，碳端序列如SEQ.ID.NO.2所示。2.如权利要求1所述的一种融合碳端的重组蛛丝蛋白，其特征在于，所述融合碳端的重组蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，由8个重复核心序列和1个碳端序列组成，编码所述融合碳端的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。3.权利要求1或2所述的一种融合碳端的重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：对pET载体上的核心序列通过酶切和连接，将含有一个碳端序列的片段和含有一个或多个核心序列的片段连接并转移至pCold I上，孵育、转化、诱导表达并纯化，制得融合碳端的重组蛛丝蛋白；其中，当核心序列为多个时，需要对核心序列进行核心序列倍增处理。4.如权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘义，黄维，孟渂偲，周科，
申请(专利权)人：四川轻化工大学，
类型：发明
国别省市：