一种壳聚糖结合域氨基酸序列的应用及酿酒酵母孢子固定化酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种壳聚糖结合域氨基酸序列的应用及酿酒酵母孢子固定化酶的方法，所述应用为利用所述壳聚糖结合域氨基酸序列在酿酒酵母孢子固定化酶中的应用，所述壳聚糖结合域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术首次选择来源于Paenibacilus sp.IK

【技术实现步骤摘要】
一种壳聚糖结合域氨基酸序列的应用及酿酒酵母孢子固定化酶的方法


[0001]本专利技术属于固定化酶
，具体涉及到一种壳聚糖结合域氨基酸序列的应用及酿酒酵母孢子固定化酶的方法。

技术介绍

[0002]二倍体酿酒酵母营养细胞在以醋酸盐为唯一碳源，并缺乏氮源的条件下，会进入减数分裂阶段形成四个单倍体的子囊孢子，经自然或人为破壁后，获得单个游离孢子。孢子壁有四层结构，从内到外依次为甘露糖层、葡聚糖层、壳聚糖层以及二酪氨酸层。酵母孢子固定化酶是基于孢子壁的特殊结构，以孢子作为一种固定化的生物材料，将酶表达或固定在孢子壁上。由于壳聚糖层对蛋白的交联作用及致密网状结构二酪氨酸层的拦截作用，在酵母孢子中表达分泌蛋白或带有分泌型信号肽的非分泌蛋白时，蛋白会被固定在壳聚糖层和二酪氨酸层之间，从而形成了孢子“微胶囊”固定化酶。
[0003]本专利技术使用一种酿酒酵母缺陷型菌株dit1Δ，该菌株缺失二酪氨酸层，其最外层为壳聚糖层。dit1Δ孢子作为一种生物固定化酶材料，在产孢的同时将酶蛋白展示在表面，经研究表明，dit1Δ孢子固定化酶的活性最高，但经反复使用后其酶活下降较快，不宜重复使用。因此，如何提高dit1Δ缺陷型酿酒酵母孢子固定化酶的活性及重复利用性依然是一个重大挑战。

技术实现思路

[0004]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0005]鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
[0006]本专利技术的其中一个目的是提供一种壳聚糖结合域氨基酸序列的应用，。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种壳聚糖结合域氨基酸序列在酿酒酵母孢子固定化酶中的应用，所述壳聚糖结合域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]作为本专利技术壳聚糖结合域氨基酸序列在酿酒酵母孢子固定化酶中的应用的一种优选方案，其中：所述壳聚糖结合域氨基酸序列来源于Paenibacilus sp.IK
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5壳聚糖酶的壳聚糖结合区域。
[0009]作为本专利技术壳聚糖结合域氨基酸序列在酿酒酵母孢子固定化酶中的应用的一种优选方案，其中：所述在酿酒酵母孢子固定化酶中的应用，利用所述壳聚糖结合域氨基酸序列与酿酒酵母孢子壁壳聚糖层的亲和能力，将目的酶与所述壳聚糖结合域氨基酸序列融合表达在酿酒酵母孢子中。
[0010]作为本专利技术壳聚糖结合域氨基酸序列在酿酒酵母孢子固定化酶中的应用的一种优选方案，其中：所述酿酒酵母孢子为酿酒酵母缺陷型菌株dit1Δ的孢子。
[0011]本专利技术的另一个目的是提供一种酿酒酵母孢子固定化酶的方法，包括，
[0012]将目的酶基因构建在含有如权利要求1所述的壳聚糖结合域氨基酸序列的表达质粒中，得到重组质粒；
[0013]将重组质粒转化到酿酒酵母缺陷型菌株dit1Δ中，得到酵母菌株；
[0014]对得到的酵母菌株利用二倍体酵母诱导产孢得到孢子固定化目的酶。
[0015]作为本专利技术酿酒酵母孢子固定化酶的方法的一种优选方案，其中：所述目的酶基因为α
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半乳糖苷酶基因。
[0016]作为本专利技术酿酒酵母孢子固定化酶的方法的一种优选方案，其中：所述表达质粒为酿酒酵母质粒pRS426。
[0017]作为本专利技术酿酒酵母孢子固定化酶的方法的一种优选方案，其中：还包括对诱导产孢后的孢子进行纯化的方法。
[0018]作为本专利技术酿酒酵母孢子固定化酶的方法的一种优选方案，其中：所述对诱导产孢后的孢子进行纯化，镜检确定酵母菌株产孢情况，低温离心收集孢子，使用灭菌水洗涤两遍后重悬于原生质体缓冲液中，加入溶壁酶摇床处理；超声破碎，镜检获得游离的单个孢子；使用预冷的灭菌水清洗后获得纯化孢子，冷冻干燥，置于
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20℃储存。
[0019]作为本专利技术酿酒酵母孢子固定化酶的方法的一种优选方案，其中：所述利用二倍体酵母诱导产孢，挑取平板上的单克隆酵母菌株，接种到SD
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Ura液体培养基中，30℃摇床培养15～20h；将菌液转接至摇瓶中，30℃摇床培养24h；离心收集酵母菌体，用2％KAc重悬菌体，于30℃培养48h诱导产孢。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0021]本专利技术寻找到一个能特异性结合底物壳聚糖的壳聚糖结合模块(chitosan binding module 32,CBM32)，利用CBM32与dit1Δ孢子壁壳聚糖层的亲和能力，实现酶蛋白在dit1Δ孢子中的固定化，且目前还没有关于CBM32在固定化酶中的研究。该方法操作简便，不需要购买商品酶，大大降低了生产成本，且绿色环保，可大量制备并能重复使用。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0023]图1为CBM32与dit1Δ孢子壁的结合能力分析图；其中A为结合能力荧光图，B为结合能力荧光强度；其中BF：Bright
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field，明场；FITC：Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素；长度标尺：5μm；
[0024]图2为孢子固定化MEL1的活性测定；
[0025]图3为孢子固定化MEL1的重复使用能力检测图；
[0026]图4为孢子固定化MEL1的稳定性分析图；其中图A为温度稳定性，图B为pH稳定性。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例
对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。
[0028]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。
[0029]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0030]实施例所用菌株如表1所示。
[0031]表1
[0032][0033]实施例所用质粒如表2所示。
[0034]表2
[0035][0036][0037]实施例1
[0038]以GFP基因序列(GenBank:ABM97852.1)为模板，利用引物GFP
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F/R经过PCR扩增得到GFP基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖结合域氨基酸序列的应用，其特征在于：所述应用为利用所述壳聚糖结合域氨基酸序列在酿酒酵母孢子固定化酶中的应用，所述壳聚糖结合域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的壳聚糖结合域氨基酸序列的应用，其特征在于：所述壳聚糖结合域氨基酸序列来源于Paenibacilus sp.IK
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5壳聚糖酶的壳聚糖结合区域。3.如权利要求1或2所述的壳聚糖结合域氨基酸序列的应用，其特征在于：所述在酿酒酵母孢子固定化酶中的应用，利用所述壳聚糖结合域氨基酸序列与酿酒酵母孢子壁壳聚糖层的亲和能力，将目的酶与所述壳聚糖结合域氨基酸序列融合表达在酿酒酵母孢子中。4.如权利要求3所述的壳聚糖结合域氨基酸序列的应用，其特征在于：所述酿酒酵母孢子为酿酒酵母缺陷型菌株dit1Δ的孢子。5.一种酿酒酵母孢子固定化酶的方法，其特征在于：包括，将目的酶基因构建在含有如权利要求1所述的壳聚糖结合域氨基酸序列的表达质粒中，得到重组质粒；将重组质粒转化到酿酒酵母缺陷型菌株dit1Δ中，得到酵母菌株；对得到的酵母菌株利用二倍体酵母诱导产孢得到孢子固定化目的酶。6.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子杰，高晓冬，李婉杰，许向阳，宋在伟，
申请(专利权)人：枣庄市杰诺生物酶有限公司，
类型：发明
国别省市：