强效双功能HIV进入抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了强效双功能HIV进入抑制剂及其应用。本发明专利技术公开的强效双功能HIV进入抑制剂为A1)或A2)：A1)由多肽2P23与抑制HIV进入的单克隆抗体ibalizumab或PRO140的单链形式连接得到的蛋白质；A2)由多肽2P23、所述抑制HIV进入的单克隆抗体ibalizumab或PRO 140的单链形式与IgG4

【技术实现步骤摘要】
强效双功能HIV进入抑制剂及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域中，强效双功能HIV进入抑制剂及其应用。

技术介绍

[0002]人免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)即艾滋病的病原体，分为HIV
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1型和HIV
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2型两种，以HIV
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1流行为主。由于HIV的高度变异和可逃避宿主免疫系统识别的特性，迄今尚无安全有效的疫苗。自1996年以来，多种药物联合使用的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)依然是可有效抑制HIV复制，大大降低与AIDS相关的发病率和死亡率以及HIV传播风险的治疗手段。该方案的不足之处是无法清除病毒储存库，一旦停药，患者体内病毒很快出现反弹，然而长期服药易引起毒副作用和耐药性(1)。因此，艾滋病治愈仍面临巨大挑战和难题。
[0003]HIV进入靶细胞的过程，由病毒包膜蛋白(Env)介导。其中，表面亚基gp120与细胞受体CD4和辅助受体CCR5或CXCR4结合，从而引起病毒包膜复合体发生构象变化(2)。跨膜亚基gp41通过将融合肽插入细胞膜，进而折叠形成6
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螺旋束结构参与病毒
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细胞融合，从而实现HIV的入侵细胞过程(3)。
[0004]因可在早期阻断病毒感染，基于入侵过程的HIV进入抑制剂成为人们研究的热点。目前，有多种进入抑制剂被广泛报道，包括蛋白质、多肽以及小分子化合物等。根据其作用靶点的不同，主要分为两大类，靶向结合病毒Env上不同表位，如广谱中和抗体VRC01、10
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1074、3BNC117、N6、10E8与多肽恩夫韦肽(T
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20)、艾博卫泰(ABT)等，和靶向结合宿主细胞表面受体或辅助受体的单克隆抗体或小分子物质，如ibalizumab(iMab)、马拉维若(maraviroc)等。
[0005]迄今，有四个HIV进入抑制剂批准用于临床治疗，包括靶向CD4的iMab(4)，CCR5变构拮抗剂maraviroc(5)，以及融合抑制剂T
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20和ABT(6,7)。其中，maraviroc仅选择性针对CCR5嗜性病毒有效，对CXCR4嗜性毒株无效；T
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20需要静脉给药，局部可出现不良反应，作为患者出现耐药后的二线用药；ABT作为全球首个长效HIV融合抑制剂，与克立芝或其他抗病毒药物联合使用，适用于耐药后的二线治疗。iMab作为首个获批用于HIV治疗的单克隆抗体，与其他药物联合应用于治疗HIV成人多重耐药感染(8)。iMab是一种人源化IgG4单克隆抗体，通过与人CD4受体的第二结构域结合，以非竞争方式阻断HIV进入，同时不影响主要组织相容性复合体II类(MHCII)受体的结合以及病毒gp120的附着(9)。2009年临床试验1b期发现，在14例接受iMab方案治疗9周的患者中，13例出现了耐药毒株，对iMab的敏感性较刚入组时变差，主要表现为iMab对上述毒株的最大抑制率降低(10)。进一步对其进行分析研究发现，gp120 V5区域N端聚糖(PNGS)的缺失是导致HIV
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1对iMab产生耐药性的主要原因，并且V2环的长度影响其耐药程度，当V5区域PNGS缺失或数量减少，V2环越长，其对iMab敏感性越低(11)。在靶向宿主细胞的单克隆抗体中，PRO140，同样是一种人源化IgG4单克隆抗体，可有效阻断HIV的感染(12)。其中，PRO 140表位位于CCR5的N端和胞外环第二结构域，通过阻断CCR5和HIV gp120的附着进而干扰病毒与宿主细胞膜的结合(13)。同其他CCR5拮抗
剂一样，PRO 140使用前需进行病毒嗜性分析。
[0006]近年来，人们对膜融合的分子机制研究越来越深入。本专利技术人实验室一直致力于开发强效HIV融合抑制剂，设计出一系列多肽，通过阻断融合蛋白gp41的HR1和HR2功能区形成六螺旋束而阻止病毒与靶细胞膜的融合。其中，通过引入M
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T钩子结构、HIV
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2序列和形成“盐桥”残基设计出HR2衍生短肽2P23，具有极强的靶序列结合能力和更高的基因耐药屏障，能有效抑制HIV
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1、HIV
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2、猴免疫缺陷病毒(SIV)和T20耐药株(14)。同时发现，基于2P23的棕榈酸修饰脂肽LP
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19具有更高的抗病毒活性和成药性，其稳定性和生物半衰期都得到显著改善(15)。究其原因，考虑是脂肽LP
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19可通过脂肪酸基团结合至细胞膜脂阀结构，从而提高了细胞膜局部的抑制剂浓度，这与六螺旋束结构以及病毒膜融合的机制相一致。
[0007]单链抗体(scFv)是由抗体重链可变区与轻链可变区在一段肽链的连接下构成的小分子，是具有抗体活性的最小功能结构单位。由于其具有分子质量小，穿透力强，免疫原性低等特点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。2019年，研究者将靶向HIV进入过程中的不同广谱中和抗体，通过以单链抗体的形式进行表达，并与其全分子抗体的活性进行比较，除外对含有特殊突变的HIV
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1毒株，两种形式的抗体抗病毒活性接近(16)。
[0008]由于HIV的高突变特性，针对HIV包膜不同表位或进入步骤的双功能或多功能抑制剂被广泛开发(17,18)。通常情况下，靶向病毒自身包膜蛋白的抑制剂比靶向宿主细胞的易于诱导出病毒耐药突变。如果一种抑制剂靶向较为保守的表位，则不易产生耐药。所以，设计双靶点或多靶点抑制剂，可提高其耐药屏障。

技术实现思路

[0009]本专利技术所要解决的技术问题是如何强效抑制HIV。
[0010]为了解决以上技术问题，本专利技术提供了强效HIV进入抑制剂。本专利技术所提供的强效HIV进入抑制剂，是针对HIV入侵靶细胞的机制而设计，不但具有极强活性和广谱性，而且耐药屏障高，从而达到提高疗效、减少给药剂量、降低病毒逃逸的目的。该抑制剂为下述A1)
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A4)中的任一种蛋白质：
[0011]A1)由多肽2P23与HIV单克隆抗体的单链抗体形式连接得到的蛋白质；
[0012]A2)由多肽2P23、所述HIV单克隆抗体的单链抗体形式与IgG4
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Fc段或其突变肽段(如IgG4
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Fc
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LS段，即将IgG4
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Fc进行突变得到的肽段)连接得到的蛋白质；
[0013]A3)在A1)或A2)中经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0014]A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质。
[0015]为了使A1)或A2)中的蛋白质便于纯化，可在A1)或A2)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0016]表：标签的序列
[0017]标签残基序列Poly
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白质，为下述A1)
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A4)中的任一种：A1)由多肽2P23与HIV单克隆抗体的单链抗体连接得到的蛋白质；A2)由多肽2P23、所述HIV单克隆抗体的单链抗体与IgG4
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Fc段或其突变肽段连接得到的蛋白质；A3)在A1)或A2)中经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述多肽2P23的序列为序列表中SEQ ID No.2的第22
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44位；和/或，所述单克隆抗体为ibalizumab或PRO 140；和/或，所述IgG4
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Fc突变肽段的序列为序列表中SEQ ID No.6的第314
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530位。3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述单克隆抗体为单链抗体。4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述单克隆抗体的序列为序列表中SEQ ID No.2的第60
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308位或SEQ ID No.4的第60
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308位。5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于：A1)所述蛋白质的序列为序列表中SEQ ID No.2的第22
‑
308位或SEQ ID No.4的第22
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308位。6.与权利要求1
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5中任一所述的蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：B1)编码权利要求1
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5中任一所述蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系。7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：何玉先，闫红霞，种辉辉，朱园美，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：