用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球、制备方法、试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球、制备方法、试剂盒及提取方法。本发明专利技术设计了能高效、快速净化处理血浆样本的高分子复合微球，并提供了能有效降低敌草快代谢物检测过程中的基质干扰效应的试剂盒，可以实现快速、准确检测中毒病人血浆样本中痕量敌草快代谢物浓度，具有十分重要的现实意义。要的现实意义。要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球、制备方法、试剂盒及提取方法


[0001]本专利技术涉及生物分析
，尤其涉及一种用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球、制备方法、试剂盒及提取方法。

技术介绍

[0002]随着百草枯在国内市场的全面禁用，敌草快的市场份额急剧上升。近年来，因自杀、误服和投毒而引起的敌草快急性中毒事件呈逐年上升趋势，敌草快已成为我国最为主要的中毒致死农药之一。然而，急性敌草快中毒临床救治研究迄今未获实质性突破，中毒病死率居高不下，已成为急性中毒防治的突出难题，造成这一现状的一个重要原因是敌草快的中毒机制尚未阐明。现有研究多集中于敌草快原型，而对其在生物体内的代谢产物和代谢机理的研究较少，一定程度上导致人们对其中毒机制认识的片面性。《急性敌草快中毒诊断与治疗专家共识》指出，敌草快可通过细胞色素P450酶氧化成单吡啶酮和双吡啶酮两种代谢产物，如图1所示。因此通过监测敌草快中毒病例血浆中单吡啶酮和双吡啶酮的浓度，能准确掌控中毒病人所处的阶段，为临床精准治疗提供强有力的技术支撑。
[0003]目前，关于中毒生物样本中敌草快代谢产物的定量分析的研究很少，F uke C.等人的研究中(Fuke C.,等.Arch Toxicol,1996,70:504
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507)，采用液相色谱
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荧光法(HPLC
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FLD)对生物样本中敌草快及其代谢物单吡啶酮和双吡啶酮进行测定，该方法存在灵敏度低、专属性差的问题，常常会得到假阳性的结果。此外，该文献采用纯水稀释和过膜方式对血浆样品进行前处理，难以除去血浆中引起基质效应的磷脂和蛋白质等杂质，不利于检测仪器的清洁，同时大量杂质的存在不利于敌草快及其代谢物的准确定量。
[0004]因此，研究一种操作简便、净化性能好的血浆样本中敌草快代谢物的提取净化技术具有十分重要的现实意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的问题是如何开发一种血浆中敌草快代谢物的提取净化技术，以达到快速、准确检测中毒病人血浆样本中痕量敌草快代谢物浓度的目的。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供一种用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球的制备方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一、制备交联琼脂糖微球；
[0008]步骤二、将步骤一得到的交联琼脂糖微球分散在FeSO4和FeCl3的混合溶液中，滴加氨水溶液反应，得到交联琼脂糖磁性微球；
[0009]步骤三、将步骤二得到的交联琼脂糖磁性微球通过沉淀聚合反应，在引发剂AIBN作用下，以交联剂二乙烯苯和功能单体4
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乙烯基苯甲酸为聚合单体，在磁性琼脂糖基表面实现羧基官能化高分子聚合物修饰，制备得到高分子复合微球。
[0010]进一步地，所述步骤三具体包括：将交联琼脂糖磁性微球超声分散于异丙醇中，将
二乙烯苯和4
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乙烯基苯甲酸溶解于乙腈中，并加入上述分散液中，加热至80～85℃，再加入AIBN的乙腈溶液，维持饭温度为82～85℃，冷凝回流12h，得到琼脂糖基弱阳离子交换高分子复合微球。
[0011]进一步地，所述步骤三中各原料用量为：交联琼脂糖磁性微球1～10g、二乙烯苯5g、4
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乙烯基苯甲酸1～10g、AIBN 0.2～0.5g。
[0012]进一步地，所述步骤S2具体包括：将交联琼脂糖微球分散在FeSO4和FeCl3的混合溶液中，FeSO4和FeCl3的摩尔比为1:2，加热反应体系至80～85℃，然后逐渐滴加氨水溶液，至反应体系溶液pH值为9.0～11.0，继续反应30～60min，反应完成后分别用纯水与乙醇清洗，真空干燥8
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12h，得到交联琼脂糖磁性微球。
[0013]本专利技术方法可以制得用于提取净化敌草快代谢物的高分子复合微球，制备过程中可根据样品类型和目标物化学结构特征，灵活调整磁性吸附材料与样品基质的相容性及对目标分析物的吸附性能；通过调节材料的功能单体4
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乙烯基苯甲酸和琼脂糖亲水基体的比例，能有效改善材料与血浆基质的相容性，从而提高净化效率；通过在材料制备过程中引入磁性组分，能实现快速固液相磁分离，极大地提高了样品净化效率；通过提高材料表面高密度羧基官能化修饰，能提高吸附材料对敌草快及其代谢物的吸附容量，进而提高血浆样品中目标化合物的提取净化回收率。
[0014]本专利技术第二方面提供一种用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球，由上述的制备方法制得。本专利技术的磁性微球对于血浆样品中敌草快代谢物单吡啶酮和双吡啶酮具有很好的吸附效果，可以实现敌草快代谢物的快速提取净化，具有十分重要的现实意义。
[0015]本专利技术第三方面提供一种试剂盒，包括吸附材料分散液，所述吸附材料分散液中的溶质为上述的用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球。
[0016]进一步地，所述吸附材料分散液的溶剂为硼酸缓冲液，pH为6.5
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9.5。
[0017]进一步地，所述吸附材料分散液中磁性微球的浓度为5
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20g/L。
[0018]进一步地，所述试剂盒还包EDTA抗凝管、注射器、标准系列工作溶液、二氧化钛粉末、离心管、洗脱液和复溶液。
[0019]本专利技术的试剂盒适合现场采样，用以针对敌草快中毒紧迫性、敌草快及其代谢物变化快的特点，该试剂盒可以配合磁力架、小型涡旋仪即可实现血浆样品的现场采样、处理与保存，后续只需将预处理样液带回实验室浓缩与复溶即可检测，大大减少了敌草快代谢物在采样和运输过程中的变化与损失，提高结果的准确度，为临床精准治疗提供更准确的结果。
[0020]本专利技术第四方面提供一种血浆中敌草快代谢物的提取方法，使用上述的试剂盒，所述提取净化方法包括以下步骤：
[0021]步骤a、移取200μL血浆样品于离心管中，加入1.0mL吸附材料分散液和5mg二氧化钛粉末，涡旋提取5
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10min，随后置于磁力架上磁分离，弃去上清液和二氧化钛粉末；
[0022]步骤b、淋洗后加入1.0mL 2％甲酸甲醇溶液洗脱，涡旋提取5
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10min，磁分离，收集上清液，氮气吹干；
[0023]步骤c、加入200μL乙腈
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水溶液进行复溶，UPLC
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HRMS进样分析。
[0024]本专利技术的敌草快代谢物的提取方法采用磁固相萃取法，能在磁场作用下实现快速
的磁分离，提高提取净化速度；且本方法与传统WCX固相萃取柱净化相比，具有更好的去除基质干扰能力，利用本方法无需采用基质匹配工作曲线或内标法即可实现准确定量分析，减少了基质匹配工作曲线配制过程的繁琐，不使用内标法定量则能大大降低成本。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：
[0026](1)本专利技术高分子复合微球采用亲水性交联琼脂糖作为基体材料，能增强吸附材料本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备交联琼脂糖微球；步骤二、将步骤一得到的交联琼脂糖微球分散在FeSO4和FeCl3的混合溶液中，滴加氨水溶液反应，得到交联琼脂糖磁性微球；步骤三、将步骤二得到的交联琼脂糖磁性微球通过沉淀聚合反应，在引发剂AIBN作用下，以交联剂二乙烯苯和功能单体4
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乙烯基苯甲酸为聚合单体，在磁性琼脂糖基表面实现羧基官能化高分子聚合物修饰，制备得到高分子复合微球。2.根据权利要求1所述的用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：将交联琼脂糖磁性微球超声分散于异丙醇中，将二乙烯苯和4
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乙烯基苯甲酸溶解于乙腈中，并加入上述分散液中，加热至80～85℃，再加入AIBN的乙腈溶液，维持饭温度为82～85℃，冷凝回流12h，得到琼脂糖基弱阳离子交换高分子复合微球。3.根据权利要求1所述的用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤三中各原料用量为：交联琼脂糖磁性微球1～10g、二乙烯苯5g、4
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乙烯基苯甲酸1～10g、AIBN 0.2～0.5g。4.根据权利要求1所述的用于提取净化血浆中敌草快代谢物的高分子复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：将交联琼脂糖微球分散在FeSO4和FeCl3的混合溶液中，FeSO4和FeCl3的摩尔比为1:2，加热反应体系至80～85℃，然后逐渐滴加氨水溶液，至反应体...

【专利技术属性】
技术研发人员：金来源，金渊源，
申请(专利权)人：浙江哈迈科技有限公司，
类型：发明
国别省市：