双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用PET塑料降解的方法技术

本发明专利技术公开双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用PET塑料降解的方法；包括基因表达及纯化带有SpyCatcher标签的MHETase，溶解于PBS缓冲液中，然后在溶液中添加CaCl2，形成杂化纳米颗粒；将带有SpyTag标签的DuraPETase通过SpyCatcher

【技术实现步骤摘要】
双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用PET塑料降解的方法


[0001]本专利技术涉及利用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解酶(DuraPETase)和对苯二酸单(羟乙)酯(MHET)降解酶(MHETase)构建双酶分层级联纳米晶体(DuraPETase@MHETase)的制备方法并将其应用于PET废弃物处理的方法，属于固定化酶


技术介绍

[0002]聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是现代社会广泛使用的一类塑料材料，给人类的生活带来了很大的便利。但是，大量难以分解的塑料废弃物堆弃在垃圾填埋场和海洋中，造成了严重的环境污染，已经为全球生态系统带来严重负担。另外，有研究者在人类粪便中发现了塑料微粒，塑料污染已经开始威胁到人类健康。对PET废弃物的传统处理方法包括填埋、焚烧、化学降解等需要消耗大量的能量，并经常产生额外的有毒有害的环境污染物；而生物降解法是一种高效环保的处理PET污染的新兴方法。2016年日本研究团队发现的一种新型的PET降解酶PETase，可以在常温下降解PET塑料，但效率较低(Yoshida,S.；Hiraga,K.；Takehana,T.；Taniguchi,I.；Yamaji,H.；Maeda,Y.；Toyohara,K.；Miyamoto,K.；Kimura,Y.；Oda,K.A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate).Science 2016,351,1196
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1199.)。2021年中国研究团队通过计算机理性设计的方法获得的突变体DuraPETase极大地改善了酶对PET的降解性能(Cui,Y.L.；Chen,Y.C.；Liu,X.Y.；Dong,S.J.；Tian,Y.E.；Qiao,Y.X.；Mitra,R.；Han,J.；Li,C.L.；Han,X.；Liu,W.D.；Chen,Q.；Wei,W.Q.；Wang,X.；Du,W.B.；Tang,S.Y.；Xiang,H.；Liu,H.Y.；Liang,Y.；Houk,K.N.；Wu,B.Computational redesign of a PETase for plastic biodegradation under ambient condition by the GRAPE strategy.ACS Catalysis.2021,11,1340
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1350.)，但一方面，为了更快更好地处理PET污染的问题，仍需通过有效的技术手段提升酶的性能；另一方面，DuraPETase只能够将PET水解为对苯二甲酸双(2
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羟乙基)酯(BHET)、对苯二酸单(羟乙)酯(MHET)和对苯二甲酸(TPA)三种单体，其中BHET和MHET对PETase具有一定的产物抑制效应，而且PET的合成需要以TPA和EG为原料，因此，利用MHET降解酶(MHETase)对DuraPETase水解PET的产物进行进一步降解，不仅能够降低或消除产物抑制，促进DuraPETase降解效率，还可以为PET的合成回收所需原料。
[0003]中国专利申请号为202110803574.2的专利技术专利申请，公开了一种“利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法”，是基于简单地将PET塑料放入PETase酶和MHETase酶的混合酶液中进行PET降解的方法，虽然可以完全将PET降解为TPA和EG，但两种酶之间没有形成有效的底物通道效应以促进对PET塑料的降解，因此本专利技术旨在通过有效的技术手段，进一步提升酶对PET的降解效率。
[0004]酶耦联形成的多酶复合体(multienzyme complexes，MECs)由于底物通道以及邻近效应机制，使各酶活性中心之间的空间距离大大缩短，生成的中间产物无需被前一个酶分子释放即可直接传递至下一个酶的活性中心，从而极大地促进了酶的协同作用，提高了催化反应效率。近年来，利用SpyTag/SpyCatcher系统构建的多酶自组装复合体越来越受到
研究者的关注和应用。SpyTag与SpyCatcher自发的成键过程反应速度快，产率高，对实验条件的适应能力强，特异性好，因此SpyTag/SpyCatcher系统对于合成生物学、代谢工程、蛋白质工程、纳米生物技术以及生物医学领域具有重要的应用价值。
[0005]利用PET降解酶对PET高效降解，有效治理塑料污染，仍然是一个巨大的挑战。因此，本专利技术拟选用纳米晶体固定化酶的方式，通过SpyTag/SpyCatcher系统将DuraPETase和MHETase进行双酶耦联，提高酶对自然界不利条件的耐性，增强对高结晶度PET的降解效率，从而推进酶的工业化应用进程。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，进而提供一种简单高效的双酶级联固定化系统的构建方法，并将其应用于PET薄膜的处理，从而推动酶处理PET废弃物的工业化应用进程。本专利技术提出了利用SpyTag/SpyCatcher系统构建双酶分层级联纳米晶体的方法，该方法得到的固定化双酶体系能够保持甚至提高酶活并大幅度地增强稳定性，制备过程简单易行、成本低廉、生物相容性好，更适合工业化应用。
[0007]本专利技术公开一种利用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解酶(DuraPETase)和对苯二酸单(羟乙)酯(MHET)降解酶(MHETase)构建双酶分层级联纳米晶体(DuraPETase@MHETase Hybrid Nanocrystals)的制备方法；包括基因表达及纯化带有SpyCatcher标签的MHETase，并将其溶解于PBS缓冲液中，然后在溶液中添加适当浓度的CaCl2，使其形成杂化纳米颗粒；将带有SpyTag标签的DuraPETase通过SpyCatcher
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SpyTag间的相互作用形成稳定的共价键，从而将DuraPETase固定在纳米颗粒表面，制备得到DuraPETase@MHETase纳米晶体；纳米粒子表面的Ca
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能够对两种酶的活性有一定的积极作用，另外，构建的双酶分层级联杂化纳米材料的高比表面积可以提高底物对酶的可及性，而纳米级基质缩短传质距离，从而实现双酶级联的底物通道效应，并提高酶对自然界不利条件的耐性以及催化活性，增强酶对高结晶度PET的降解效率，从而推动酶处理PET废弃物的工业化应用进程。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种利用PET降解酶和MHET降解酶构建双酶分层级联纳米晶体(DuraPETase@MHETase)的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)首先构建双酶分层级联纳米晶体所需的融合蛋白DuraPETase
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SpyTag和MHETase
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SpyCatcher的表达载体和菌株，并进行蛋白表达及纯化，表达载体DuraPETase
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SpyTag
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双酶分层级联纳米晶体的构建方法；其特征是，包括如下步骤：(1)首先构建双酶分层级联纳米晶体所需的融合蛋白DuraPETase
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SpyTag和MHETase
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SpyCatcher的表达载体和菌株，并进行蛋白表达及纯化；(2)将CaCl2水溶液加入MHETase
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SpyCatcher蛋白的PBS缓冲液中，静置；(3)将所得混合液进行离心，收集沉淀；(4)将所述沉淀用过膜水清洗后溶解于PBS缓冲液中，得到MHETase杂化纳米晶体；(5)将所构建的MHETase纳米晶体与DuraPETase
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SpyTag酶混合；(6)将混合液孵育，使DuraPETase
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SpyTag通过与MHETase
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SpyCatcher及Ca
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之间的共价及配位相互作用包封于MHETase杂化纳米晶体表面；(7)然后进行离心，收集沉淀，用过膜水洗后溶解于PBS缓冲液中，得到DuraPETase@MHETase双酶分层级联杂化纳米晶体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述Ca
2+
终浓度为10.0
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20.0mM，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙彦，陈坤，董晓燕，史清洪，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：