一种受茉莉酸甲酯诱导的人参PgWRKY40基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体提供了一种受茉莉酸甲酯诱导的人参PgWRKY40基因及其应用，该调节人参皂苷积累的PgWRKY40基因来自受茉莉酸甲酯诱导表达后的人参，PgWRKY40基因序列如SEQ ID NO.1所示，PgWRKY40基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该PgWRKY40基因编码的蛋白具有典型的WRKYGQK序列，属于WRKY转录因子。本发明专利技术构建的PgWRKY40基因超表达载体通过发根农杆菌A4介导转化人参叶片，人参叶片中PgWRKY40基因的瞬时表达水平显著升高，该瞬时超表达PgWRKY40基因的人参叶片中人参皂苷的含量得到明显提高，在利用基因工程提高人参皂苷产量方面具有潜在的应用价值。价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
一种受茉莉酸甲酯诱导的人参PgWRKY40基因及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种受茉莉酸甲酯诱导的人参PgWRKY40基因及其应用。

技术介绍

[0002]人参为五加科人参属植物，是我国名贵的中药材，在许多亚洲国家已经有几千年的使用历史，人参中的次生代谢产物人参皂苷是其最主要的药效成分。人参皂苷的生物合成受多种转录因子的调控。因此，研究人参皂苷积累及其转录调控机制具有重要的理论和应用价值。WRKY是植物中重要的转录因子家族之一，广泛参与植物的生长、发育、生物或非生物胁迫响应等多种生理过程，最近研究发现该家族成员参与多种次生代谢物合成的调控，然而，有关人参WRKY转录因子调控人参皂苷的生物合成研究甚少。
[0003]为此，本文采用生物信息学、分子生物学、植物化学等方法对人参WRKY家族成员的种类、结构特征、表达谱、以及其与人参皂苷积累进行关联分析，筛选参与人参皂苷生物合成与积累调控的候选WRKY转录因子，进而实现利用WRKY转录因子持久高效的调控人参皂苷生物合成与积累，以提高人参皂苷含量和人参的药用价值，对于精准调控人参皂苷的积累、规模化高效生产人参皂苷具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提出了一种受茉莉酸甲酯诱导的人参PgWRKY40基因及其应用，其目的是通过茉莉酸甲酯诱导后筛选出PgWRKY40转录因子基因转化人参组织并表达，从而促进人参细胞中人参皂苷生物合成与积累，达到提高人参皂苷产量的目的。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40转录因子基因，所述受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40转录因子基因序列如SEQ ID NO.1所示，该受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40转录因子基因来自人参。
[0006]作为优选，所述PgWRKY40基因序列的获得方法为：提取经茉莉酸甲酯诱导后的人参发根总RNA，反转录合成cDNA，根据茉莉酸甲酯诱导的人参转录组测序所获得的候选基因序列信息设计PCR扩增引物，进行扩增获得PgWRKY40基因。
[0007]作为优选，所述茉莉酸甲酯的诱导时间为12～72h，更优选为12～24h。
[0008]作为优选，所述的PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0009]作为优选，所述的一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]作为优选，所述的受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因与植物表达载体组成重组载体。
[0011]作为优选，所述表达载体为pCAMBIA1302。
[0012]作为优选，所述重组载体的构建方式如下：以所述一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因的开放读码框作为超表达序列，将该cDNA片段插入到植物表达载体
pCAMBIA1302中制得。
[0013]基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供了一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因在调节人参皂苷积累中的应用。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0015]本专利技术采用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的人参根基因差异表达的转录组测序方法，初步筛选出人参WRKY转录因子家族基因，再通过发根农杆菌A4介导的转化人参叶片实验，从多个人参WRKY转录因子基因中筛选到受MeJA显著诱导的PgWRKY40转录因子，经MeJA诱导后获得的PgWRKY40转录因子基因编码的蛋白具有典型的七肽序列WRKYGQK，属于植物WRKY转录因子；筛选获得的PgWRKY40基因及其编码的蛋白参与到人参皂苷生物合成与积累的调控，PgWRKY40基因在瞬时超表达的人参叶片中表达，从而达到提高人参皂苷产量的目的，该基因及其编码的蛋白是一种切实可行的提高人参中皂苷含量的方法；
[0016]本专利技术通过构建了PgWRKY40转录因子基因的植物超表达载体，利用发根农杆菌A4介导PgWRKY40转录因子基因转化人参叶片，通过PgWRKY40转录因子基因在人参叶片中瞬时高水平表达，介导转化PgWRKY40基因后人参叶片中PgWRKY40基因的表达水平可以达到对照组的3倍以上；与对照人参叶片相比，PgWRKY40转录因子基因瞬时超表达人参叶片中人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1和Rg3各个单体均得到有效提高，从而使得人参总皂苷含量显著提高，可以达到对照组的2倍。由此说明，利用基因编辑PgWRKY40转录因子基因能够获得人参总皂苷含量提高的人参组织或植株，为提高人参总皂苷产量提供了一种有效的技术手段。
附图说明
[0017]图1是本专利技术实施例1中PgWRKY40基因PCR产物电泳结果，图中，泳道1、2和3均表示PCR扩增产物，M表示DNA标准分子量；
[0018]图2是本专利技术实验例1中荧光定量PCR(qRT
‑
PCR)检测100μmol/L外源性MeJA处理不同时间后人参发根中PgWRKY40转录因子基因的表达水平，以β
‑
actin作为内参；
[0019]图3是本专利技术实验例2中PgWRKY40转录因子基因植物超载体表达框示意图；
[0020]图4是本专利技术实验例2中qRT
‑
PCR检测发根农杆菌A4介导转化人参叶片中PgWRKY40基因瞬时表达水平；
[0021]图5是本专利技术实验例2中发根农杆菌A4介导转化PgWRKY40转录因子基因的人参叶片中人参皂苷含量。
具体实施方式
[0022]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。
[0023]实施例1
[0024]PgWRKY40转录因子基因的克隆
[0025]1、人参RNA提取及其反转录合成cDNA
[0026](1)人参RNA提取
[0027]取1/2MS固体培养基中培养的人参发根，将其接种于1/2MS液体培养基中，在
120rpm、25℃暗培养3周，然后在培养基中加入终浓度为100μmol/L的MeJA，再以同样的条件培养24h，诱导与MeJA有关的基因表达。
[0028]取MeJA诱导24h的人参发根，快速置于液氮预冷的研钵内，立即加入液氮后快速研磨成细粉。取40mg于1.5mL无RNA酶的离心管中，加入1mL TRIzol和40μLβ
‑
巯基乙醇，快速混匀后置于室温放置5
‑
10min；加入0.2mL氯仿，振摇l5s，室温放置10min；4℃，12000
×
g离心15min，收集上层置于于1.5mL离心管中，弃去沉淀；再加入0.4mL 3mol/L醋酸铵(pH5.2)和0.6mL异丙醇后混匀，室温放置10min，4℃、12000
×
g离心10min，弃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因，其特征在于，所述PgWRKY40基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因，其特征在于，所述PgWRKY40基因序列的获得方法为：提取经茉莉酸甲酯诱导后的人参发根总RNA，反转录合成cDNA，根据茉莉酸甲酯诱导的人参转录组测序所获得的候选基因序列信息设计PCR扩增引物，进行扩增获得PgWRKY40基因。3.根据权利要求2所述的一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因，其特征在于，所述的PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求1所述的一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因，其特征在于，所述的一种受茉莉酸甲酯诱导的PgWRKY40基因编码的蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：张儒，李昭影，张变玲，谭时泉，蒋开军，吴小杰，邹俊，
申请(专利权)人：湖南工程学院，
类型：发明
国别省市：