特异性靶向mCNα的二元环肽配体及其获得方法技术

特异性靶向mCNα的二元环肽配体及其获得方法，涉及生物医药领域。所述特异性靶向mCNα的二元环肽配体，由一条含有三个半胱氨酸的线性多肽链和一个小分子组成；小分子与线性多肽链的偶联使得原本的线性多肽链成为二元环肽；所述特异性靶向mCNα的二元环肽配体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～12所示。先构建噬菌体展示二元环肽库：将二元环肽库用于mCNα蛋白配体的筛选，选取富集最多的多肽进行合成，然后与小分子2ClAc

【技术实现步骤摘要】
特异性靶向mCN
α
的二元环肽配体及其获得方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，尤其是涉及基于噬菌体展示技术获得与mCNα具有高亲合力结合的特异性靶向mCNα的二元环肽配体及其获得方法。

技术介绍

[0002]钙调神经磷酸酶(CN)，是唯一已知的由钙和钙调蛋白(CaM)直接调节的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。CN将Ca
2+
信号与细胞反应关联，从而具有多种生物学功能，并在许多生理过程中发挥关键作用，包括免疫反应、细胞凋亡、肌肉分化、骨形成和神经元信号传导等。CN最典型的底物是活化的T细胞(NFAT)转录因子家族(Mancini M,Toker A.NFAT proteins:emerging roles in cancer progression.Nat Rev Cancer2009；9:810
‑
820.)。CN直接与细胞质中的NFAT转录因子结合，导致它们去磷酸化并随后易位到细胞核中。由于其在T细胞活化中的作用，CN已成为开发免疫抑制剂药物的主要目标。迄今为止发现的两种最成功的抑制剂是环孢菌素A(CsA)和他克莫司(FK506)，它们分别与胞内蛋白亲环蛋白A(CyPA)和FKBP12结合。生成的CyPA
‑
CsA和FKBP12
‑
FK506复合物抑制NFAT蛋白的去磷酸化，从而阻断它们的核输入(Liu J,Farmer JD Jr,Lane WS,Friedman J,Weissman I,Sch
‑
reiber SL.Calcineurin is acommon target of cyclophilin
‑
cyc
‑
losporin A and FKBP
‑
FK506 complexes.Cell 1991；66:807
‑
815.)。
[0003]CN是一种异二聚体磷酸酶，由催化亚基钙调磷酸酶A(CNA)和调节亚基钙调磷酸酶B(CNB)组成。除了催化结构域外，CNA还包含一个B亚基结合螺旋(BBH)、一个CaM结合结构域(CBD)和一个自身抑制结构域(AID)，它们共同构成了A亚基的调节结构域(RD)。调节亚基CNB包含四个Ca
2+
结合环并与CAN的BBH紧密结合。mCNα是全长的钙调神经磷酸酶，包含上述的结构组成，命名为鼠源CNα(Li,S.J.；Wang,J.；Ma,L.；Lu,C.；Wang,J.；Wu,J.W.；Wang,Z.X.Cooperative autoinhibition and multi
‑
level activation mechanisms of calcineurin[J].Cell Res.,2016,26(3):336
‑
349.)。目前发现的配体与该蛋白结合的亲合力都不是很高，由于CN在许多生理过程中发挥关键作用，因此发现其新型配体是有必要的。
[0004]多肽逐渐成为研究蛋白质
‑
蛋白质相互作用的一类重要分子(Craik,D.J.；Fairlie,D.P.；Liras,S.；Price,D.The future of peptide
‑
based drugs[J].Chem.Biol.Drug Des.,2013,81(1):136
‑
147.)。多肽分子量介于小分子和生物大分子之间，具有独特的性质，其能够与靶标的大表面积建立大量的非共价相互作用，产生更高的选择性和更好的亲合力。而多肽也有其固有的劣势，比如抵抗酶解稳定性差，口服给药时容易降解等。研究者们通过很多方法来提高多肽的稳定性，其中最直接最简单的方法就是将多肽环化。而通过多肽的位点特异性反应，借助含有反应性官能团的小分子将多肽环化是其中最直观最具多样性的方法之一。二元环肽无疑是环肽分子中更具治疗潜力的一种。Heinis等人利用三(溴甲基)苯分子修饰噬菌体展示多肽库筛选靶标蛋白的方法已经开发出多种用于临床的二元环肽药物(Heinis,C.；Rutherford,T.；Freund,S.；Winter,
G.Phage
‑
encoded combinatorial chemical libraries based on bicyclic peptides[J].Nat.Chem.Biol.,2009,5(7):502
‑
507.)。
[0005]另一方面，噬菌体展示技术，即将多肽或者蛋白质展示于丝状噬菌体表面，是一种能够从大量多肽库中提取出所需要多肽的体外筛选技术，其作为一种基础的研究工具，已成为药物发现和开发中极其强大的手段。将噬菌体展示多肽库翻译后化学修饰，即通过设计的有机小分子与噬菌体展示多肽库反应，构建噬菌体展示环肽库。这种方法最直观最简单，且得到的环肽分子特别稳定。通过有机小分子的引入，丰富噬菌体展示多肽库的多样性，赋予其更多的结构与功能。筛选得到的环肽配体亲合力高，稳定性强。C.L.Wu等(Zheng,X.；Li,Z.；Gao,W.；Meng,X.；Li,X.；Luk,L.Y.P.；Zhao,Y.；Tsai,Y.H.；Wu,C.Condensation of2
‑
((Alkylthio)(aryl)methylene)malononitrile with 1,2
‑
Aminothiol as a Novel Bioorthogonal Reaction for Site
‑
Specific Protein Modification and Peptide Cyclization[J].J.Am.Chem.Soc.,2020,142(11):5097
‑
5103.)发展了1,2
‑
氨基硫醇与2
‑
((烷硫基)(芳基)亚甲基)丙二腈反应，该反应可以在生物相容的条件下，高效，特异性地迅速发生，经历硫醇
‑
乙烯基硫醚交换，环化和二氰基甲烷离去的过程，最终形成稳定的五元噻唑环。将该反应用于噬菌体展示环肽库的构建，得到一系列靶标蛋白的高亲合力环肽配体。
[0006]本专利技术是基于噬菌体展示二元环肽库来筛选和生成针对mCNα的二元环肽配体。借助二元环肽的高亲合力与高稳定性，发展对钙调神经磷酸酶(CN)靶点的相关研究。
[0007]氨基酸包括所谓的标准或规范氨基酸。这20个α
‑
氨基酸直接由通用遗传密码的密码子编码。它们是真核生物中发现的蛋白质α
‑
氨基酸。

技术实现思路

[0008]本专利技术的第一目的在于提供合成简单、生物相容性好、构象稳定、抗酶解稳定性强，与靶标蛋白结合具有高特异性与高亲合力的特异性靶向mCNα的二元环肽配体。
[0009]本专利技术的第二目的在于提供特异性靶向mCNα的二元环肽配体的获得方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异性靶向mCNα的二元环肽配体，其特征在于其由一条含有三个半胱氨酸的线性多肽链和一个小分子组成；所述小分子与线性多肽链的偶联使得原本的线性多肽链成为二元环肽；所述多肽包括但不限于以下序列：CIVLTAPNGRCELLDC(peptide 1)CTGPHIIITDCTHHEC(peptide 2)CIVLTAPNGRCELRDC(peptide 3)CGVIILINGICDECHC(peptide 4)GIVLTAPNGRCELLDC(peptide 5)CRSNQEIPQVCVNGLC(peptide 6)CAEDWRIPRICVTGEC(peptide 7)CIVLTAPNGRCELVDC(peptide 8)CIVLTAPTGRCELLDC(peptide 9)CIVLTAPNGRCELLDC(peptide 10)CNCLSYQDTNCYEYRC(peptide 11)CIVLTAPNGRCELLEC(peptide 12)所述特异性靶向mCNα的二元环肽配体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～12所示。2.如权利要求1所述特异性靶向mCNα的二元环肽配体的获得方法，其特征在于包括以下步骤：1)基于噬菌体展示技术构建噬菌体展示二元环肽库；2)将步骤1)中所得噬菌体展示二元环肽库用于mCNα蛋白配体的筛选；3)选取步骤2)中富集最多的多肽进行合成，与小分子2ClAc
‑
3.5反应得到二元环肽配体分子，表征二元环肽配体分子与mCNα的亲合力。3.如权利要求1所述特异性靶向mCNα的二元环肽配体的获得方法，其特征在于在步骤1)中，所述构建噬菌体展示二元环肽库的具体方法为：(1)噬菌体展示线性多肽库的序列骨架由N端到C端如下：C(X)9C(X)4C其中，氨基酸均为L型氨基酸，X代表任意氨基酸，下标代表含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴川六，张士龙，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：