一种产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供的产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明专利技术提供的产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体能够特异性结合产气荚膜梭菌β毒素蛋白，对该蛋白的灵敏度为最低为0.3125μg/ml；能以ELISA的方法检测羊和羊驼粪便中的产气荚膜梭菌β毒素，灵敏度为1μg/ml。ml。

【技术实现步骤摘要】
一种产气荚膜梭菌
β
毒素纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体及其应用。

技术介绍

[0002]骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，单域抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体得优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性的屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如GPCR、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单；同时纳米抗体的分子量小，结构简单，更有利于进行基因改造，纳米抗体人源化修饰等特性。
[0003]产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，又称魏氏梭菌(Clostridium welchii)，也称产气荚膜芽孢杆菌。目前，已发现产气荚膜梭菌产生的毒素和酶多达20种，其中α毒素(CPA)，β毒素(CPB)，ε毒素(ETX)，ι毒素(ITX)是其产生的最主要的毒素，也是诱导疾病发生的主要毒素。β毒素可以由B型和C型产气荚膜梭菌产生，是人类和动物坏死性小肠结肠炎和肠毒素血症的主要毒素。制备产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体，一方面可以成为快速检测产气荚膜梭菌β毒素的工具，另一方面可以作为治疗产气荚膜梭菌β毒素引起的疾病提供方法，目前尚未有产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体的有关研究。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种对产气荚膜梭菌β毒素蛋白具有较好的灵敏度的产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体，可用于产气荚膜梭菌β毒素的检测。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体，所述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]本专利技术还提供了一种编码上述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供了一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
[0009]本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述细胞表达上述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体或含有上述表达载体。
[0010]本专利技术还提供了一种上述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体或上述核苷酸序列在制备检测产气荚膜梭菌β毒素产品中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种上述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体或上述核苷酸序列在制备
检测与产气荚膜梭菌β毒素有关疾病产品中的应用。
[0012]优选的，所述疾病包括坏死性小肠结肠炎和肠毒素血症。
[0013]优选的，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸和探针。
[0014]本专利技术还提供了一种非诊断目的的检测粪便中产气荚膜梭菌β毒素的方法，包括以下步骤：以畜禽粪便作为抗原包被酶标板，以上述纳米抗体为一抗进行ELISA检测。
[0015]优选的，所述ELISA方法中的二抗为His
‑
HRP抗体。
[0016]本专利技术的有益效果：
[0017]本专利技术提供的产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体，不仅能够特异性结合产气荚膜梭菌β毒素蛋白，而且对该蛋白的灵敏度较好，最低可达到0.3125μg/ml。以ELISA的方法检测羊和羊驼粪便中的产气荚膜梭菌β毒素时，灵敏度可达到1μg/ml。
附图说明
[0018]图1为第一轮PCR
‑
VHH凝胶电泳图；
[0019]图2为第二轮PCR
‑
VHH电泳图；
[0020]图3为平板检测β毒素
‑
VHH纳米文库库容结果；
[0021]图4为平板检测β毒素
‑
VHH纳米文库丰度结果；
[0022]图5为PCR检测β毒素
‑
VHH纳米文库插入率结果；
[0023]图6为软件分析50个样品序列对应的氨基酸序列结果；
[0024]图7为SDS
‑
PAGE检测纯化的产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体；
[0025]图8为Western Blot法检测产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体，所述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0027]在本专利技术中，所述纳米抗体的氨基酸序列如下：
[0028]ESGGGLVQTGGSLRLSCVASLSGGRVSVNTIEWHRQVPGKQRELVAGITRSGTPNYSEFAKGRFTISRENAKNTVYLQMNNLKPDDTAVYLCNVRADTLIGSTGAIEHQYWGQGTEVIVSS。
[0029]本专利技术还提供了一种上述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：
[0030]1)将产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体文库进行第一轮淘洗，得到β毒素
‑
VHH1；所述第一轮淘洗的产气荚膜梭菌β毒素蛋白的包被浓度优选为18～22μg/ml；
[0031]2)将所述步骤1)得到的β毒素
‑
VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；所述第二轮淘洗的产气荚膜梭菌β毒素蛋白的包被浓度优选为8～12μg/ml；所述第三轮淘洗的产气荚膜梭菌β毒素蛋白的包被浓度优选为3～8μg/ml；所述第四轮淘洗的产气荚膜梭菌β毒素蛋白的包被浓度优选为3～8μg/ml；
[0032]3)将所述步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
[0033]4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第
二上清液同产气荚膜梭菌β毒素蛋白的反应性，以确定所述菌株与产气荚膜梭菌β毒素蛋白具有反应性；
[0034]所述第一振荡的温度优选为35～42℃，所述第二振荡的温度优选为28～32℃；
[0035]所述第一离心的离心力优选为7500～8500g，所述第二离心的离心力优选为2000～2100g；
[0036]5)将所述步骤4)与产气荚膜梭菌β毒素蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
[0037]所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体，其特征在于，所述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种编码权利要求1所述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种含有权利要求2所述核苷酸序列的表达载体。4.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1所述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体或含有权利要求3所述表达载体。5.权利要求1所述产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体或权利要求2所述核苷酸序列在制备检测产气荚膜梭菌β毒素产品中的应用。6.权利要求1所述产气荚膜梭菌β毒素...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾琼，杜孩，范瑞文，胡世雄，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：