一种耐酸酿酒酵母及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐酸酿酒酵母及其应用，属于代谢工程技术领域。本发明专利技术以酿酒酵母S288C为出发菌株，敲除酿酒酵母S288C的ROX1转录调控因子中的结构域HMG，或将ROX1转录调控因子中的G158A进行突变，得到所述耐酸酿酒酵母。本发明专利技术对ROX1进行了5种不同程度的突变，实验数据表明，当ROX1结构域HMG不同程度的破坏后，同样能达到很好的耐酸效果：pH2.32条件下，与野生型菌株WT相比生长表型(最大OD

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸酿酒酵母及其应用


[0001]本专利技术属于代谢工程
，尤其是指一种耐酸酿酒酵母及其应用。

技术介绍

[0002]酿酒酵母因其生长周期短、发酵能力强、规模化生产性能好等优点，成为微生物发酵生产的主要底盘细胞之一。近年来，研究人员专注于提高酿酒酵母对各种胁迫的耐受性，例如温度、pH值、渗透压(盐类、醇类)等，以提高细胞在不同环境中的耐受性。例如，为了获得能够耐受高温并产生乙醇的酿酒酵母菌株，将具有高乙醇生产力的同型菌株与表现出耐高温表型的异型菌株进行杂交，得到杂交TJ14，该菌株可以合成乙醇在高温下有效。为了增加细胞对乙醇(这是酵母细胞最常见的压力)的耐受性，现已报道的耐受乙醇的机制主要与膜成分的变化，以及稳定或修复变性蛋白质相关。
[0003]此外，基于特定环境设计细胞抗逆的能力可能会在基础研究和生物制造中有所应用，而酿酒酵母的耐酸一直受到研究者的高度关注。例如，通过实验室适应性进化获得了能够耐受芳香酸(pH3.5)的菌株，进一步分析表明，芳香酸转运蛋白ESBP6的过表达是提高对低pH耐受性的关键因素。同时，先前的报道表明，质子泵PMA1和PMA2的过表达能够增加酵母的耐酸性，并且Pdr18(ABC转运蛋白)参与酵母对乙酸胁迫的反应。然而，质子泵或其他ABC转运蛋白可以增强菌株的耐酸性，但只能提高对弱酸(pH4.0
‑
5.8)的耐受性。因此，目前酵母的耐酸性还远远不能满足工业生产所形成的较低pH环境的需要。
[0004]目前报道的微生物生产有机酸主要是添加中和剂(碳酸钙等)来调节发酵过程的低pH，形成有机酸盐，后续要经过酸解、分离、纯化等繁琐程序。一方面增加了产物分离、纯化的成本和工序，另一方面如果前期添加的中和剂，还会造成资源的浪费和环境的污染。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种耐酸酿酒酵母及其应用。因此，本专利技术提供新的耐酸机制及构建方法，为耐酸底盘细胞的构建提供理论基础。
[0006]本专利技术的第一个目的在于提供一种耐酸酿酒酵母，以酿酒酵母S288C为出发菌株，敲除酿酒酵母S288C的ROX1转录调控因子中的结构域HMG，或将ROX1转录调控因子中的G158A进行突变，得到所述耐酸酿酒酵母；所述ROX1转录调控因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0007]在本专利技术的一个实施例中，所述G158A突变后的位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]在本专利技术的一个实施例中，敲除所述ROX1中的8aa
‑
91aa片段、54aa
‑
368aa片段、1aa
‑
53aa片段、1aa
‑
7aa片段或92aa
‑
368aa片段中的一个或多个。
[0009]在本专利技术的一个实施例中，敲除8aa
‑
91aa片段后，所述ROX1转录调控因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]在本专利技术的一个实施例中，敲除54aa
‑
368aa片段后，所述ROX1转录调控因子的核
苷酸序列如SEQ ID NO.所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所述。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，敲除1aa
‑
53aa片段后，所述ROX1转录调控因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0012]在本专利技术的一个实施例中，同时敲除1aa
‑
7aa片段和92aa
‑
368aa片段后，所述ROX1转录调控因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0013]本专利技术的第二个目的在于提供含所述的耐酸酿酒酵母的产品。
[0014]本专利技术的第三个目的在于提供所述的耐酸酿酒酵母，或所述的产品在发酵生产L
‑
苹果酸中的应用。
[0015]在本专利技术的一个实施例中，所述发酵的条件：发酵温度28
‑
32℃，发酵时间60
‑
108h。
[0016]为了解决目前已获取的耐酸酿酒酵母耐受极低pH的问题，本专利技术首先提供了一种转录调控因子ROX1及其突变体mROX1，其中mROX1碱基的第158位由G突变为A，相应的氨基酸由色氨酸Trp突变为终止密码子，且该突变位点位于ROX1的结构域HMG(8aa
‑
91aa)中。通过逆向工程，在野生型酿酒酵母的ROX1中进行相应的点突变G158A，验证了ROX1突变体在酵母耐酸过程中发挥的重要作用：pH 2.32条件下，与野生型菌株WT相比生长表型(最大OD
600
)提高15.41倍，最大生长速率为0.37h
‑1；同时，为了进一步分析ROX1在耐酸过程中的功能，以及其它突变是否具有耐酸的作用，本专利技术中，对ROX1进行了其它5种不同程度的突变，实验数据表明，当ROX1结构域HMG不同程度的破坏后，同样能达到很好的耐酸效果：pH 2.32条件下，与野生型菌株WT相比生长表型(最大OD
600
)提高14
‑
15倍。
[0017]本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0018]在本专利技术中，发现转录调控ROX1及其突变体基因在酿酒酵母中可以有效的提高对低pH的耐受能力。实验数据表明与野生型酿酒酵母相比，转录调控因子ROX1的不同突变体，可使耐酸表型提高15倍左右。同时，以耐酸菌株WTΔROX1为底盘细胞，代谢改造合成L
‑
苹果酸，发酵过程中不添加中和剂的情况下，耐酸菌株WTΔROX1苹果酸产量是菌株WT的2.5倍。因此，对于构建耐酸酿酒酵母具有较高的应用价值。
附图说明
[0019]为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中
[0020]图1为本专利技术转录调控因子ROX1及其突变体mROX1耐酸验证分析。
[0021]图2为本专利技术转录调控因子ROX1其它突变体耐酸功能分析。
[0022]图3为本专利技术耐酸酿酒酵母合成L
‑
苹果酸分析。
具体实施方式
[0023]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0024]实施例1转录调控因子ROX1及其突变体mROX1耐酸功能验证
[0025](1)以野生型酿酒酵母S288C基因组模版，采用引物(mROX1
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F，mROX1
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R，mROX本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐酸酿酒酵母，其特征在于，以酿酒酵母S288C为出发菌株，敲除酿酒酵母S288C的ROX1转录调控因子中的结构域HMG，或将ROX1转录调控因子中的G158A进行突变，得到所述耐酸酿酒酵母；所述ROX1转录调控因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。2.根据权利要求1所述的耐酸酿酒酵母，其特征在于，所述G158A突变后的位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的耐酸酿酒酵母，其特征在于，敲除所述ROX1中的8aa
‑
91aa片段、54aa
‑
368aa片段、1aa
‑
53aa片段、1aa
‑
7aa片段或92aa
‑
368aa片段中的一个或多个。4.根据权利要求3所述的耐酸酿酒酵母，其特征在于，敲除8aa
‑
91aa片段后，所述ROX1转录调控因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.根据权利要求3所述的耐酸酿酒酵母，其特征在于，敲除54aa

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，孙利，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：