赭曲霉甾体C11α-羟化酶CYP68J5突变体构建及其应用制造技术

本发明专利技术提供了赭曲霉甾体C11α

【技术实现步骤摘要】
赭曲霉甾体C11
α
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羟化酶CYP68J5突变体构建及其应用

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[0001]本专利技术应用基因工程和酶工程技术，具体是赭曲霉甾体C11α
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羟化酶CYP68J5突变体构建及其应用。

技术介绍
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[0002]甾体类药物是治疗各种衰弱性疾病(如风湿性关节炎、炎症、过敏和癌症等)以及避孕的不可或缺的一类药物。鉴于甾体母核某些位置，尤其是C11α位置的羟基官能团的存在，对于提高甾体类药物生理和药理活性至关重要，或者可以用作简化甾体药物化学合成的关键中间体，能够对甾体化合物进行区域和立体选择性羟基化的催化剂是实现生产各种甾体药物的基本化学工具。因为甾体化合物远程C
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H键的羟基化无法通过常规化学手段实现，甾体的微生物转化能够通过一步将氧原子插入甾体分子的远程非活化的C
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H键，并具有极好的区域和立体选择性，为工业生产有价值的中间体提供了有效的解决方案。
[0003]丝状真菌是甾体选择性羟基化商业菌株的主要来源。由于赭曲霉(Aspergillus ochraceus)具有高水平的羟基化活性和较高的羟基化反应选择性，通常用于制备C11α
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羟孕酮和C11α
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羟左旋乙基甾烯双酮(双酮)，它们是合成生产各种高价值糖皮质激素和“第三代”口服避孕药的活性成分地索格司特的关键中间体。尽管赭曲霉菌株因其相对较高的活性而成为甾体C11α
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羟基化的一些首选工业生物催化剂，但它们在商业相关甾体底物的C11α
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羟基化反应特异性方面存在很大差异。赭曲霉的生产菌株对底物孕酮表现出适度的C11α
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羟基化选择性(约30％的副产物形成)，而对底物双酮表现出较低的C11α
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羟基化选择性(约40％的副产物形成)。因此，我们克隆鉴定了赭曲霉TCCC41060中的C11α
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羟化酶基因CYP68J5。C11α
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羟化酶CYP68J5用于选择性甾体C
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H功能化以制备关键中间体的用途受到底物偏好的限制。细胞色素P450单加氧酶的工程已成功用于改善酶的性质，包括酶的稳定性、活性、区域选择性和立体选择性，扩大底物范围，甚至反应类型，因为P450单加氧酶的活性位点(底物结合口袋)中的残基非常容易被取代。
[0004]为了改善赭曲霉C11α
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羟化酶CYP68J5基因对底物孕酮和双酮的羟化特异性，利用定点突变技术对其进行分子水平上的改造，筛选获得了一个对孕酮具有高羟化特异性C11α
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羟化酶基因突变体V64K(90.6％VS野生型69.7％)和一个对双酮具有高羟化特异性C11α
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羟化酶基因突变体N66D(70.8％VS野生型58％)，并且50mL规模的重组酵母过表达V64K转化孕酮的结果显示C11α
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羟孕酮浓度为432.5mg/L，比对照CYP68J5提高了30.2％，为研究开发绿色高效孕酮和双酮C11α
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羟化工艺奠定了坚实的基础。

技术实现思路
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[0005]针对现有甾体孕酮和双酮羟化产物特异性不高的现状，本专利技术的第一个目标是利用分子操作技术构建重组表达载体，在酿酒酵母中进行异源表达，筛选出C11α
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高羟化特异性的突变体V64K和N66D。本专利技术的第二个目标是评估已实现孕酮高羟化特异性突变体V64K在培养基放大条件下的表现，建立了基于重组酿酒酵母菌的高羟化特异性C11α
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羟化反应
工艺。
[0006]本专利技术所述的CYP68J5基因来源于赭曲霉。
[0007]本专利技术未定点突变的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]本专利技术中突变体V64K氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0009]本专利技术中突变体N66D氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，以上序列属于本专利技术的保护范围。
[0010]利用本专利技术所述的编码C11α羟化酶的基因CYP68J5所构建的表达载体、重组表达质粒或宿主细胞也属于本专利技术的保护范围，所使用的扩增引物序列、针对基因片段CYP68J5定点突变所涉及氨基酸位点也属于本专利技术的保护范围。
[0011]本专利技术所述的经定点突变技术获得的突变基因CYP68J5编码的甾体化合物羟化酶包括但不限于酿酒酵母等宿主细胞内表达。
[0012]与现有技术相比，本专利技术有益效果在于：
[0013]通过重组酵母菌突变体甾体转化实验，获得高羟化特异性C11α
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羟化酶基因突变体V64K和N66D，对甾体孕酮和双酮的转化特异性显著高于基因野生型菌株，本专利技术的研究成果具有重要的商业应用价值。并且重组酿酒酵母孕酮C11α
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羟化工程菌的构建为研究开发高效孕酮C11α
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羟化生产工艺提供了宝贵材料(基因和菌种)和基础数据支撑。
[0014]说明书附图：
[0015]图1双酮和孕酮的C11α
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羟基化反应
[0016]图2基因重组菌突变体V64K、N66D PCR扩增产物条带琼脂糖凝胶电泳图
[0017]其中：M为DNA Marker，1
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2分别是突变体V64K、N66D PCR扩增产物条带；
[0018]图3基因重组菌突变体V64K、N66D产物纯化琼脂糖凝胶电泳图
[0019]其中：M为DNA Marker，1
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2分别是突变体V64K、N66D PCR产物纯化条带；
[0020]图4基因重组菌突变体V64K、N66D酶切验证琼脂糖凝胶电泳图
[0021]其中：M为DNA Marker，1
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2是突变体V64K质粒经双酶切验证图，3
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4是
[0022]突变体N66D质粒经双酶切验证图；
[0023]图5，基因重组菌突变体V64K转化底物孕酮TLC图
[0024]图6基因重组菌突变体N66D转化底物双酮TLC图
[0025]图7基因重组菌突变体V64K转化放大培养图
[0026]图8突变体V64K和基因野生型CYP68J5转化放大HPLC结果图。
具体实施方式：
[0027]下面通过具体的实施方案叙述本专利技术方法。除非特别说明，本专利技术所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0028]本专利技术中涉及菌株：酿酒酵母(Saccharomyces cerevi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.赭曲霉甾体C11α
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羟化酶CYP68J5突变体构建，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在如SEQ ID NO：1所示的序列基础上进行突变：突变体V64K的64位氨基酸由原来的缬氨酸(GTT)突变成赖氨酸密码(AAA)；突变体N66D的66位氨基酸由原来的天冬酰胺(AAT)突变成天冬氨酸密码(GAT)。2.如权利要求1所述的赭曲霉甾体C11α
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羟化酶CYP68J5突变体构建的应用，其特征在于，用于工业转化甾体孕酮和双酮生产C11α
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羟...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓光，路福平，毛淑红，曾玉龙，杨滨瑞，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：