引物组及使用其检测目标核酸的方法技术

本发明专利技术的一个以上实施方式的目的在于解决用于制备能够在固相载体上检测的目标核酸的扩增产物的、使用添加了多核苷酸标签的引物的核酸扩增反应中的反应效率的降低。本发明专利技术的一个以上实施方式涉及一种引物组，其包含第1引物、第2引物及第3引物，所述第1引物包含第1多核苷酸和第1多核苷酸标签，所述第1多核苷酸在3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】引物组及使用其检测目标核酸的方法


[0001]本专利技术的一个以上实施方式涉及用于通过核酸扩增反应制备能够在固相载体上进行检测的目标核酸的扩增产物的引物组。
[0002]另外，本专利技术的一个以上实施方式涉及包含上述引物组的用于检测目标核酸的试剂盒。
[0003]另外，本专利技术的一个以上实施方式涉及包括使用上述引物组进行核酸扩增反应的目标核酸的检测方法。
[0004]另外，本专利技术的一个以上实施方式涉及包含2个以上上述引物组的多重引物组。

技术介绍

[0005]近年来，作为操作性优异、迅速且简便的目标核酸的检测方法，基于色谱法的基因检测方法备受关注(例如参照专利文献1)。该方法的概要如下所述。通过使用添加了对核酸扩增反应独立的多核苷酸标签的多核苷酸引物的核酸扩增反应，对目标核酸进行扩增，生成添加了多核苷酸标签的目标核酸片段。另一方面，将与上述多核苷酸标签结合的探针(例如上述多核苷酸标签的互补多核苷酸)预先固定于色谱仪用的测试条。然后，将包含添加了标签的目标核酸片段的试样施加于该测试条，利用毛细管现象在测试条中展开，将目标核酸片段捕获于上述探针，进行检测。
[0006]另一方面，作为核酸扩增方法，与为了试样的温度变化而需要热循环仪的PCR方法不同，开发了在恒温下对目标基因进行扩增的等温核酸扩增法。等温核酸扩增法具有能够用简便的装置实施、反应时间短且检测灵敏度高等适于POC(Point of Care)检查的应用的特性。作为等温核酸扩增法，已知有RPA法(Recombinase Polymerase Amplification)、TRIAmp法(Tandem Repeat
‑
mediated Isothermal Amplification)、LAMP法(Loop
‑
mediated isothermal amplification)、HDA法(Helicase
‑
dependent amplification)等方法。
[0007]作为公开将添加了多核苷酸标签的多核苷酸引物用于等温核酸扩增法的现有技术文献，可以举出专利文献2及专利文献3。
[0008]在专利文献2中记载了在LAMP法所使用的6个引物中对给定的2个添加标签序列和标记物质结合物质、以及在固相载体上捕捉使用其进行扩增得到的扩增产物并进行检测。
[0009]在专利文献3中记载了在基于新原理的等温核酸扩增法中对引物添加与核酸扩增反应独立的标签。
[0010]现有技术文献
[0011]专利文献
[0012]专利文献1：日本特开2016
‑
73312号公报
[0013]专利文献2：WO2017/43114
[0014]专利文献3：WO2018/038232
[0015]专利文献4：日本专利第5688702号公报
[0016]非专利文献
[0017]非专利文献1：(Frontiers in Microbiology.vol.8，Article192)

技术实现思路

[0018]专利技术要解决的课题
[0019]本专利技术人等发现，在PCR法、等温核酸扩增法等核酸扩增反应中，与使用未添加标签的引物的情况相比，使用添加了多核苷酸标签的引物的情况下，有时核酸扩增反应的效率降低。另外发现，在使用链置换型聚合酶的等温扩增反应中，有时使用添加多核苷酸标签的引物所导致的核酸扩增反应的效率降低特别明显。
[0020]因此，在本专利技术的一个以上的实施方式中，将用于制备能够在固相载体上检测的目标核酸的扩增产物的、使用添加了多核苷酸标签的引物的核酸扩增反应的反应效率降低作为待解决的课题。
[0021]解决课题的方法
[0022]在本说明书中，作为上述解决课题的方法，公开了以下的专利技术。
[0023](1)一种引物组，其用于通过核酸扩增反应制备能够在固相载体上检测的目标核酸的扩增产物，其中，
[0024]上述引物组包含第1引物、第2引物及第3引物，
[0025]上述第1引物包含第1多核苷酸和第1多核苷酸标签，所述第1多核苷酸在3
’
末端包含能够与目标核酸的5
’
末端的部分多核苷酸A
’
的互补链进行杂交的多核苷酸A，所述第1多核苷酸标签为连接于上述第1多核苷酸的5
’
末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，
[0026]上述第2引物包含第2多核苷酸，所述第2多核苷酸在3
’
末端包含能够与上述目标核酸的3
’
末端的部分多核苷酸B
’
进行杂交的多核苷酸B，
[0027]上述第3引物包含第3多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第3多核苷酸在3
’
末端包含能够与上述第1引物的上述多核苷酸A竞争性地对上述目标核酸的互补链进行杂交的多核苷酸C。
[0028](2)根据(1)所述的引物组，其中，上述第3引物的上述多核苷酸C能够与上述目标核酸的上述部分多核苷酸A
’
的互补链中包含的50％以上的碱基数的多核苷酸进行杂交。
[0029](3)根据(1)或(2)所述的引物组，其中，相对于上述第1引物和上述第3引物的总量，上述第3引物的比率为1摩尔％以上且90摩尔％以下。
[0030](4)根据(3)所述的引物组，其中，相对于上述第1引物和上述第3引物的总量，上述第3引物的比率为2.5摩尔％以上且75摩尔％以下。
[0031](5)根据(1)～(4)中任一项所述的引物组，其中，在上述第1引物中，上述第1多核苷酸标签的3
’
末端与上述第1多核苷酸的5
’
末端经由抑制核酸扩增反应的抑制物质连接在一起。
[0032](6)根据(1)～(5)中任一项所述的引物组，其中，上述第2引物进一步包含连接于上述第2多核苷酸的标记物质。
[0033](7)根据(6)所述的引物组，其中，上述标记物质为生物素、荧光色素或半抗原。
[0034](8)根据(1)～(5)中任一项所述的引物组，其中，上述引物组进一步包含第4引物，
[0035]上述第2引物进一步包含第2多核苷酸标签，所述第2多核苷酸标签是连接于上述
第2多核苷酸的5
’
末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，
[0036]上述第4引物包含第4多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第4多核苷酸在3
’
末端包含能够与上述第2引物的上述多核苷酸B竞争性地对上述目标核酸进行杂交的多核苷酸D。
[0037](9)根据(8)所述的引物组，其中，上述第4引物的上述多核苷酸D能够与上述目标核酸的上述部分多核苷酸B
’
中包含的50％以上的碱基数的多核苷酸进行杂交。
[0038](10)根据(8)或(9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种引物组，其用于通过核酸扩增反应制备能够在固相载体上检测的目标核酸的扩增产物，其中，所述引物组包含第1引物、第2引物及第3引物，所述第1引物包含第1多核苷酸和第1多核苷酸标签，所述第1多核苷酸在3
’
末端包含能够与目标核酸的5
’
末端的部分多核苷酸A
’
的互补链进行杂交的多核苷酸A，所述第1多核苷酸标签为连接于所述第1多核苷酸的5
’
末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第2引物包含第2多核苷酸，所述第2多核苷酸在3
’
末端包含能够与所述目标核酸的3
’
末端的部分多核苷酸B
’
进行杂交的多核苷酸B，所述第3引物包含第3多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第3多核苷酸在3
’
末端包含能够与所述第1引物的所述多核苷酸A竞争性地对所述目标核酸的互补链进行杂交的多核苷酸C。2.根据权利要求1所述的引物组，其中，所述第3引物的所述多核苷酸C能够与所述目标核酸的所述部分多核苷酸A
’
的互补链中包含的50％以上的碱基数的多核苷酸进行杂交。3.根据权利要求1或2所述的引物组，其中，相对于所述第1引物和所述第3引物的总量，所述第3引物的比率为1摩尔％以上且90摩尔％以下。4.根据权利要求3所述的引物组，其中，相对于所述第1引物和所述第3引物的总量，所述第3引物的比率为2.5摩尔％以上且75摩尔％以下。5.根据权利要求1～4中任一项所述的引物组，其中，所述第2引物进一步包含连接于所述第2多核苷酸的标记物质。6.根据权利要求1～4中任一项所述的引物组，其中，所述引物组进一步包含第4引物，所述第2引物进一步包含第2多核苷酸标签，所述第2多核苷酸标签是连接于所述第2多核苷酸的5
’
末端、且相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第4引物包含第4多核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫本重彦，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：