修饰的核酸内切酶和相关方法技术

提供了用于产生具有降低的脱靶活性的修饰的核酸内切酶，如CRISPR/Cas9系统的组合物和方法。还公开了体外和体内使用所述修饰的核酸内切酶编辑多核苷酸的方法。一方面，公开内容提供了修饰的核酸内切酶，包括核酸内切酶和与所述核酸内切酶共价连接的一个或多个混合电荷部分，其中每个混合电荷部分包括约10至约400个带正电荷的部分和约10至约400个带负电荷的部分，并且其中带正电荷的部分的数目与带负电荷的部分的数目的比率为约1：0.5至约1：2。2。2。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的核酸内切酶和相关方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年10月11日提交的美国临时申请第62/913,916号的权益，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]关于序列表的声明
[0004]与该申请相关的序列表以文本格式提供，替代纸印本，并且特此通过引用并入说明书中。包括序列表的文本文件的名称为72968_SEQ_final
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2020
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10
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7.txt。文本文件大小为27.2KB，于2020年10月7日创建，并随同说明书的提交通过EFS
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web提交。
[0005]政府许可权利的声明
[0006]该专利技术是在美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的批准号为R21 GM128004号的政府支持下完成的。政府对专利技术拥有某些权利。
[0007]背景
[0008]CRISPR/Cas系统是在各种生物体和细胞类型中广泛使用的用于基因组编辑的工具。不幸的是，它也可能在类似于在靶序列的脱靶位点引起不需要的突变。脱靶突变是由CRISPR/Cas9 RNP对DNA序列的非特异性识别引起的。已经证明，除了最佳PAM序列5
’‑
NGG
‑3’
之外，Cas9还可以采用5
’‑
NAG
‑3’
或5
’‑
NGA
‑3’
PAM切割位点，尽管效率较低。此外，20nt单向导RNA(sgRNA)可识别具有多至3
‑
5个与sgRNA的碱基对错配的DNA序列，表明在人类基因组中给定核酸酶存在多达数千个可能的结合位点。此外，与RNA引导链相比，CRISPR/Cas9可以诱导对包含几个额外碱基(
‘
DNA凸起
’
)或几个缺失碱基(
‘
RNA凸起
’
)的DNA序列的脱靶切割。脱靶DNA切割可在非预期的基因组基因座产生突变和产生总染色体重排，如缺失、倒位和易位。这些在不需要的位点的突变可能使抑癌基因失效或激活致癌基因。已知易位是慢性髓性白血病的可能原因。
[0009]防止、避免或至少减少这些脱靶效应对于任何下游基因组编辑应用的成功都是至关重要的。已经开发了各种策略来减少通常使用的Cas9核酸酶的基因组范围的脱靶突变，包括带有缩短的靶互补区的截短的sgRNA、Cas9突变体、配对的Cas9切口酶，以及无催化活性的Cas9与非特异性FokI核酸酶的二聚融合体。然而，这些方法仅部分有效和/或有产生更多脱靶位点的可能性。此外，它们还可能需要表达多个sgRNA和/或将额外的功能结构域融合到Cas9，这会缩小靶向范围，并对使用具有有限的核酸有效载荷大小的病毒载体进行递送造成挑战。
[0010]因此，仍然需要可以减少CRISPR/Cas9系统的脱靶效应的简单稳健的策略和具有减少的脱靶效应的CRISPR/Cas9系统。
[0011]概述
[0012]提供该概述从而以简化形式介绍将在以下详细描述中进一步描述的一些概念。该概述不旨在确认所要求保护的主题的关键特征，也不旨在被用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
[0013]一方面，公开内容提供了一种修饰的核酸内切酶，其包括核酸内切酶和与核酸内切酶共价连接的一个或多个混合电荷部分，其中每个混合电荷部分包括约10至约400个带
正电荷的部分和约10至约400个带负电荷的部分，并且其中带正电荷的部分的数目与带负电荷的部分的数目的比率为约1：0.5至约1：2。在一些实施方案中，混合电荷部分在约7.4的pH下基本上是电中性的。
[0014]在一些实施方案中，核酸内切酶是核酸引导的核酸酶系统蛋白。在一些实施方案中，核酸内切酶是CRISPR相关(Cas)蛋白，如Cas9、Cas12、Cas13、Cas14，或其突变体或变体。在一些实施方案中，核酸内切酶是Cas9或其突变体或变体。
[0015]在一些实施方案中，核酸内切酶在CRISPR/Cas系统中具有活性，其中CRISPR/Cas系统相对于野生型CRISPR/Cas系统表现出降低的脱靶编辑活性和维持的在靶编辑活性。在一些实施方案中，与未修饰的核酸内切酶相比，脱靶编辑活性降低至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％。
[0016]在一些实施方案中，混合电荷部分与核酸内切酶的氨基酸的侧链、核酸内切酶的N端氨基和/或核酸内切酶的C端羧基共价连接。
[0017]在一些实施方案中，混合电荷部分是分子量为约2kDa至约130kDa的肽。
[0018]在一些实施方案中，修饰的核酸内切酶是融合蛋白，其中混合电荷部分是由以下组成的混合电荷结构域：
[0019]a)多个带负电荷的氨基酸；
[0020]b)多个带正电荷的氨基酸；以及
[0021]c)任选的多个独立地选自脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸及其衍生物的另外的氨基酸；以及
[0022]其中带正电荷的氨基酸的数目与带负电荷的氨基酸的数目的比率为约1：0.5至约1：2。
[0023]在一些实施方案中，混合电荷结构域包括随机序列。在一些实施方案中，混合电荷结构域包括序列(X1
‑
X2
‑
X3)
n
，其中X1是带正电荷的氨基酸，X2是带负电荷的氨基酸，并且X3不存在或是独立地选自脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸及其衍生物的另外的氨基酸，其中n是约5至约50的整数。
[0024]在一些实施方案中，多个带负电荷的氨基酸独立地选自天冬氨酸、谷氨酸及其衍生物。在一些实施方案中，多个带正电荷的氨基酸独立地选自赖氨酸、组氨酸、精氨酸及其衍生物。在一些实施方案中，混合电荷结构域不包括多个另外的氨基酸。在一些实施方案中，多个带正电荷的氨基酸是赖氨酸，多个带负电荷的氨基酸是谷氨酸。
[0025]在一些实施方案中，混合电荷结构域包括多个赖氨酸和多个选自谷氨酸和天冬氨酸的带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，混合电荷结构域包括多个组氨酸和多个选自谷氨酸和天冬氨酸的带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，多个另外的氨基酸选自脯氨酸、丝氨酸和甘氨酸。在一些实施方案中，多个另外的氨基酸是多个脯氨酸。在一些实施方案中，混合电荷结构域包括多个赖氨酸，多个谷氨酸和多个脯氨酸。
[0026]在一些实施方案中，混合电荷部分是分子量为约2kDa至约80kDa的合成聚合物。在一些实施方案中，聚合物选自聚(羧基甜菜碱)(PCB)、聚(磺基甜菜碱)(PSB)、聚(2
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甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(PMPC)和聚(氧化三甲胺)(TMAO)聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚(羧基甜菜碱)(PCB)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰的核酸内切酶，其包括核酸内切酶和与所述核酸内切酶共价连接的一个或多个混合电荷部分，其中每个混合电荷部分包括约10至约400个带正电荷的部分和约10至约400个带负电荷的部分，并且其中带正电荷的部分的数目与带负电荷的部分的数目的比率为约1：0.5至约1：2。2.权利要求1所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是核酸引导的核酸酶系统蛋白。3.权利要求1或2中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是CRISPR相关(Cas)蛋白。4.权利要求1
‑
3中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是Cas9、Cas12、Cas13、Cas14，或其突变体或变体。5.权利要求1
‑
4中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶是Cas9或其突变体或变体。6.权利要求1
‑
5中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷部分在约7.4的pH下基本上是电中性的。7.权利要求1
‑
6中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶在CRISPR/Cas系统中具有活性，其中所述CRISPR/Cas系统相对于野生型CRISPR/Cas系统表现出降低的脱靶编辑活性和维持的在靶编辑活性。8.权利要求7所述的修饰的核酸内切酶，其中与未修饰的核酸内切酶相比，所述脱靶编辑活性降低至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％。9.权利要求1
‑
8中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷部分与所述核酸内切酶的氨基酸的侧链、所述核酸内切酶的N端氨基和/或所述核酸内切酶的C端羧基共价连接。10.权利要求1
‑
9中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷部分是分子量为约2kDa至约130kDa的肽。11.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述的修饰的核酸内切酶是融合蛋白，其中所述混合电荷部分是由以下组成的混合电荷结构域：a)多个带负电荷的氨基酸；b)多个带正电荷的氨基酸；以及c)任选的多个独立地选自脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸及其衍生物的另外的氨基酸；以及其中带正电荷的氨基酸的数目与带负电荷的氨基酸的数目的比率为约1：0.5至约1：2。12.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述多个带负电荷的氨基酸独立地选自天冬氨酸、谷氨酸及其衍生物。13.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述多个带正电荷的氨基酸独立地选自赖氨酸、组氨酸、精氨酸及其衍生物。14.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷结构域不包括多个另外的氨基酸。15.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述多个带正电荷的氨基酸是赖氨酸，
并且多个带负电荷的氨基酸是谷氨酸。16.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷结构域包括随机序列。17.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷结构域包括序列(X1
‑
X2
‑
X3)
n
，其中X1是带正电荷的氨基酸，X2是带负电荷的氨基酸，并且X3不存在或是独立地选自脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸及其衍生物的另外的氨基酸，其中n是约5至约50的整数。18.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷结构域包括多个赖氨酸和多个选自谷氨酸和天冬氨酸的带负电荷的氨基酸。19.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷结构域包括多个组氨酸和多个选自谷氨酸和天冬氨酸的带负电荷的氨基酸。20.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述多个另外的氨基酸选自脯氨酸、丝氨酸和甘氨酸。21.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述多个另外的氨基酸是多个脯氨酸。22.权利要求10所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷结构域包括多个赖氨酸、多个谷氨酸和多个脯氨酸。23.权利要求1
‑
9中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述混合电荷部分是分子量为约2kDa至约80kDa的合成聚合物。24.权利要求23所述的修饰的核酸内切酶，其中所述聚合物选自聚(羧基甜菜碱)(PCB)、聚(磺基甜菜碱)(PSB)、聚(2
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甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(PMPC)和聚(氧化三甲胺)(TMAO)聚合物。25.权利要求23或24中任一项所述的修饰的核酸内切酶，其中所述聚合物是聚(羧基甜菜碱)(PCB)。26.一种核酸，其包括编码权利要求1
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22中任一项所述的修饰的核酸内切酶的序列。27.一种表达载体，其包括权利要求26所述的核酸和与其可操作连接的启动子。28.一种细胞，其包括权利要求26所述的核酸或权利要求27所述的表达载体。29.权利要求28所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。30.权利要求28所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。31....

【专利技术属性】
技术研发人员：袁哲凡，江绍毅，Y，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：