RNA编码的DNA置换等位基因的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及包含V型CRISPR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA编码的DNA置换等位基因的组合物和方法
[0001]关于序列表电子递交的声明
[0002]提供根据37 C.F.R.
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1.821提交的标题为1499
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12WO_ST25.txt、大小为768,694字节、于2020年11月5日生成并通过EFS
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Web提交的ASCII文本格式的序列表用于代替纸质副本。该序列表在此通过引用并入本说明书的公开内容。
[0003]优先权声明
[0004]本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求2019年11月5日提交的美国临时申请第62/930,836号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
专利

[0005]本专利技术涉及包含V型CRISPR
‑
Cas效应蛋白、逆转录酶和延伸指导核酸的重组核酸构建体及其用于修饰植物中的核酸的方法。
[0006]专利技术背景
[0007]碱基编辑已被证明是将胞嘧啶和腺嘌呤残基分别改变为胸腺嘧啶和鸟嘌呤的有效方法。这些工具虽然功能强大，但确实有一些限制，例如旁观者碱基、小碱基编辑窗口，除非具有高PAM密度的酶可以补偿，否则对性状相关靶的可及性有限，将胞嘧啶和腺嘌呤分别转化为除胸腺嘧啶和鸟嘌呤之外的残基的能力有限，并且不能编辑胸腺嘧啶或鸟嘌呤残基。因此，目前可用于碱基编辑的工具是有限的。因此，为了通过提高对更多生物的可能编辑范围来使核酸编辑更有用，需要新的编辑工具。
[0008]专利技术概述
[0009]第一方面提供了一种修饰靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸与以下接触：(a)V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白；(b)逆转录酶，和(c)延伸指导核酸(例如，延伸II型或V型CRISPR RNA、延伸II型或V型CRISPR DNA、延伸II型或V型crRNA、延伸II型或V型crDNA)，从而修饰靶核酸。
[0010]第二方面提供了一种修饰靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸在第一位点与以下接触：(a)(i)第一CRISPR
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Cas效应蛋白；和(ii)第一延伸指导核酸(例如，延伸CRISPR RNA、延伸CRISPR DNA、延伸crRNA、延伸crDNA)；和(b)(i)第二CRISPR
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Cas效应蛋白；(ii)第一逆转录酶；和(ii)第一指导核酸，从而修饰靶核酸。
[0011]第三方面提供了一种修饰植物或植物细胞中的靶核酸的方法，其包括将本专利技术的表达盒引入植物或植物细胞中，从而修饰植物或植物细胞中的靶核酸并产生包含修饰的靶核酸的植物或植物细胞。
[0012]第四方面提供了一种复合物，其包含：(a)V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白；(b)逆转录酶，和(c)延伸指导核酸(例如，延伸CRISPR RNA、延伸CRISPR DNA、延伸crRNA、延伸crDNA；例如，靶向等位基因指导(tag)核酸(即tagDNA、tagRNA))。
[0013]第五方面提供了一种针对在生物中表达进行密码子优化的表达盒，该表达盒从5'至3'包含(a)编码植物特异性启动子序列(例如，ZmUbi1、MtUb2、RNA聚合酶II(Pol II))的多核苷酸，(b)编码V型CRISPR
‑
Cas核酸酶(例如，Cpf1(Cas12a)、dCas12a等)的针对植物进
行密码子优化的多核苷酸；(c)接头序列；和(d)编码逆转录酶的针对植物进行密码子优化的多核苷酸。
[0014]第六方面提供了一种针对在生物中表达进行密码子优化的表达盒，该表达盒包含：(a)编码启动子序列的多核苷酸，和(b)延伸RNA指导序列，其中延伸指导核酸包含延伸部分，所述延伸部分在其3
’
端包含引物结合位点和待并入靶核酸中的编辑(例如，逆转录酶模板)，任选地其中延伸指导核酸包含在表达盒中，任选地其中延伸指导核酸可操作地连接至Pol II启动子。
[0015]本专利技术还提供了细胞，包括包含通过本专利技术的方法修饰的靶核酸的植物细胞、细菌细胞、古菌细胞、真菌细胞、动物细胞，以及生物，包括植物、细菌、古菌、真菌和动物，包括细胞。此外，本专利技术提供了包含本专利技术的多核苷酸、多肽和表达盒的试剂盒。
[0016]本专利技术的这些和其他方面在以下本专利技术的描述中更详细地阐述。
[0017]附图的简要说明
[0018]图1提供了显示从crRNA的逆转录产生DNA序列并随后整合到切口位点中的示意图。延伸指导crRNA(tagRNA)与Cpf1切口酶(cas12a切口酶)(nCpf1，左上)结合。或者，编码编辑模板的延伸可以位于crRNA的5'。crRNA的3'末端与缺口位点的DNA互补(非粗体配对线，左上)。nCpf1可以与逆转录酶(RT)共价连接，也可以将RT募集到nCpf1，在这种情况下，可以将多个逆转录酶蛋白募集到nCpf1。RT聚合来自第二链上DNA切口3'端的DNA，生成与crRNA互补的DNA序列，其中核苷酸与基因组不互补(粗体配对线，大括号，右上)，然后是互补核苷酸(非粗体配对线，右上)。解离后，得到的DNA具有延伸单链DNA，带有3'突出端，与原始DNA的序列基本相同(非粗体配对线，右下)，但有一些非天然核苷酸(粗体配对线，大括号，右下)。该瓣与具有5'突出端(左下)的结构处于平衡状态，其中错配的核苷酸并入DNA中。可以通过减少错配修复、在修复和复制期间去除5'瓣以及还通过如本文所述将第一链造成切口来驱动平衡朝向左侧结构。
[0019]图2提供了显示用于减少错配修复的方法的示意图。为了驱动更利于形成具有修饰核苷酸(粗体，大括号)的最终产物的平衡，引导切口酶(通过指导核酸)切割RT编辑区域之外的区域(闪电)中的靶核酸的第一链(例如，靶链或下链)——距第二链(例如，靶链或上链)中的切口的距离。nCpf1:crRNA分子可能位于编辑泡的任一侧或两侧上。将第一链造成切口(虚线)向细胞表明新并入的核苷酸是错配修复和复制期间的正确核苷酸，因此有利于具有新核苷酸的最终产物。驱动平衡朝向所需产品的其他可能方式可以包括移除5'瓣。
[0020]图3显示了使用本专利技术的组合物修饰核酸的替代方法，其中在第二链中引入两个切口，并且由RT引入的序列取代双切口WT序列，从而更有效地并入基因组。
[0021]图4.LbCas12a_R1138A是体外实验证明的切口酶，在1％TAE
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琼脂糖凝胶上分离。超螺旋2.8kB质粒以2.0kB的表观大小运行(泳道2)，直到野生型LbCas12a产生双链断裂(泳道3)。
[0022]图5显示了在大肠杆菌中测试的REDRAW编辑器的配置(参见实施例1)。
[0023]图6显示了在第一文库中测试的tagRNA的构造。
[0024]图7显示了用于REDRAW编辑的示例设计发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸与以下接触：(a)V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白；(b)逆转录酶，和(c)延伸指导核酸(例如，延伸II型或V型CRISPR RNA、延伸II型或V型CRISPR DNA、延伸II型或V型crRNA、延伸II型或V型crDNA)，从而修饰靶核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中V型CRISPR
‑
Cas效应蛋白或II型CRISPR
‑
Cas效应蛋白、逆转录酶和延伸指导核酸形成复合物或包含在复合物中。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中延伸指导核酸包含：(i)V型CRISPR核酸或II型CRISPR核酸(II型或V型CRISPR RNA、II型或V型CRISPR DNA、II型或V型crRNA、II型或V型crDNA)和/或CRISPR核酸和tracr核酸(例如，II型或V型tracrRNA、II型或V型tracrDNA)；和(ii)包含引物结合位点和逆转录酶模板(RT模板)的延伸部分。4.根据权利要求3所述的方法，其中延伸部分融合至CRISPR核酸的5'端或3'端(例如，从5'至3'：重复
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间隔区
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延伸部分，或延伸部分
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重复
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间隔区)和/或tracr核酸的5'或3'端。5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中延伸指导核酸的延伸部分从5'至3'包含RT模板和引物结合位点。6.根据权利要求5所述的方法，其中靶核酸是双链的并且包含第一链和第二链，并且引物结合位点结合至靶核酸的第二链(非靶链，上链)。7.根据权利要求5所述的方法，其中靶核酸是双链的并且包含第一链和第二链，并且引物结合位点结合至靶核酸的第一链(例如，结合至靶链，与CRISPR
‑
Cas效应蛋白被募集到的链相同的链，下链)。8.根据权利要求5所述的方法，其中靶核酸是双链的并且包含第一链和第二链，并且引物结合位点结合至靶核酸的第二链(非靶链，CRISPR
‑
Cas效应蛋白被募集到的链的相对链)。9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中引物结合位点的长度为约1个核苷酸至约100个核苷酸，任选地，其中引物结合位点的长度为至少45个核苷酸，或约45个核苷酸至约100个核苷酸。10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中RT模板的长度为约1至约100个核苷酸，任选地，其中RT模板的长度为约40个核苷酸或更短。11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中延伸指导RNA的延伸部分通过接头与CRISPR核酸和/或tracrRNA连接。12.根据权利要求11所述的方法，其中接头的长度为1至100个核苷酸。13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中当延伸部分位于crRNA的5'时，V型CRISPR
‑
Cas效应蛋白被修饰以降低(或消除)自加工RNA酶活性。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白是融合蛋白和/或逆转录酶是融合蛋白，其中V型CRISPR
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Cas融合蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白、逆转录酶融合蛋白和/或延伸指导核酸融合至将逆转录酶募
集到V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白的一种或多种组分，任选地，一种或多种组分通过蛋白质
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蛋白质相互作用、蛋白质
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RNA相互作用和/或化学相互作用进行募集。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白是V型CRISPR
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Cas效应融合蛋白，其包含融合(连接)至肽标签(例如，表位或多聚化表位)的V型CRISPR
‑
Cas效应蛋白结构域，并且逆转录酶是逆转录酶融合蛋白，其包含融合(连接)至与肽标签结合的亲和多肽的逆转录酶结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种逆转录酶融合蛋白接触，或者，II型CRISPR
‑
Cas效应蛋白是II型CRISPR
‑
Cas效应融合蛋白，其包含融合(连接)至肽标签(例如，表位或多聚化表位)的II型CRISPR
‑
Cas效应蛋白结构域，并且逆转录酶是逆转录酶融合蛋白，其包含融合(连接)至与肽标签结合的亲和多肽的逆转录酶结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种逆转录酶融合蛋白接触。16.根据权利要求15所述的方法，其中肽标签包括GCN4肽标签(例如，Sun
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Tag)、c
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Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、甲硫氨酸
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His亲和标签、RGD
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His亲和标签、FLAG八肽、strep标签或strep标签II、V5标签和/或VSV
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G表位。17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中肽标签包括2个或更多个拷贝的肽标签。18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中亲和多肽是抗体、亲和体、anticalin、单体和/或DARPin。19.根据权利要求18所述的方法，其中抗体是scFv抗体。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中延伸指导核酸连接至RNA募集基序，并且逆转录酶是逆转录酶融合蛋白，其包含融合(连接)至与RNA募集基序结合的亲和多肽的逆转录酶结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种逆转录酶融合蛋白接触，任选地其中延伸指导RNA连接至两个或更多个RNA募集基序，任选地其中两个或更多个RNA募集基序是相同的RNA募集基序或不同的RNA募集基序。21.根据权利要求1520所述的方法，其中募集基序位于延伸指导核酸的延伸部分的3'端或嵌入延伸部分中。22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中RNA募集基序和相应的亲和多肽是端粒酶Ku结合基序(例如，Ku结合发夹)和Ku的亲和多肽(例如，Ku异二聚体)；端粒酶Sm7结合基序和Sm7的亲和多肽；MS2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽MS2包被蛋白(MCP)、PP7噬菌体操纵子茎环和亲和多肽PP7包被蛋白(PCP)；SfMu噬菌体Com茎环和亲和多肽Com RNA结合蛋白；PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem
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3mRNA结合因子(PUF)；和/或合成的RNA
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适配体和相应的适配体配体。23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中RNA募集基序和相应的亲和多肽是MS2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽MS2包被蛋白(MCP)和/或PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem
‑
3mRNA结合因子(PUF)。24.根据权利要求14所述的方法，其中募集化学相互作用的一种或多种组分是雷帕霉素诱导的FRB
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FKBP二聚化；生物素
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链霉抗生物素蛋白；SNAP标签；Halo标签；CLIP标签；化合物诱导的DmrA
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DmrC异二聚体；双功能配体(例如，两种蛋白质结合化学物质融合在一起；例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使靶核酸与以下接触：(a)CRISPR
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Cas效应蛋白；和(b)指导核酸，其中(i)CRISPR
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Cas效应蛋白在位于距第二链上已被II型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白造成切口的位点约10至约125个碱基对(5'或3')的靶核酸的第一链上的位点造成切口或切割，或者，(ii)CRISPR
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Cas效应蛋白在位于距第一链上已被II型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白造成切口的位点约10至约125个碱基对(5'或3')的靶核酸的第二链上的位点造成切口或切割，从而改善错配修复，其中CRISPR
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Cas效应蛋白是I型、II型、III型、IV型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使靶核酸与Dna2多肽和/或5'瓣内切核酸酶(FEN)、任选地FEN1多肽接触。27.根据权利要求26所述的方法，其中FEN和/或Dna2多肽过表达(在靶核酸存在下)。28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中FEN是融合蛋白，其包含融合至II型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白或结构域的FEN结构域，和/或，其中Dna2多肽是融合蛋白，其包含融合至II型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白或结构域的Dna2结构域。29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白是V型CRISPR
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Cas融合蛋白，其包含融合(连接)至肽标签(例如，表位或多聚化表位)的V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域，并且FEN是FEN融合蛋白，其包含融合至与肽标签结合的亲和多肽的FEN结构域，和/或，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白是V型CRISPR
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Cas融合蛋白，其包含融合至肽标签的V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域，并且Dna2多肽是Dna2融合蛋白，其包含融合至与肽标签结合的亲和多肽的Dna2结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种FEN融合蛋白和/或两种或更多种Dna2融合蛋白接触，从而将FEN和/或Dna2募集到V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域和靶核酸。30.根据权利要求1
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28中任一项所述的方法，其中II型CRISPR
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Cas效应蛋白是II型CRISPR
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Cas融合蛋白，其包含融合(连接)至肽标签(例如，表位或多聚化表位)的II型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域，并且FEN是FEN融合蛋白，其包含融合至与肽标签结合的亲和多肽的FEN结构域，和/或，其中II型CRISPR
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Cas效应蛋白是II型CRISPR
‑
Cas融合蛋白，其包含融合至肽标签的II型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域，并且Dna2多肽是Dna2融合蛋白，其包含融合至与肽标签结合的亲和多肽的Dna2结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种FEN融合蛋白和/或两种或更多种Dna2融合蛋白接触，从而将FEN和/或Dna2募集到II型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域和靶核酸。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中逆转录酶融合至一个或多个单链RNA结合结构域(RBD)。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白是Cas12a(Cpf1)结构域、Cas12b(C2c1)结构域、Cas12c(C2c3)结构域、Cas12d(CasY)结构域、Cas12e(CasX)结构域、Cas12g结构域、Cas12h结构域、Cas12i结构域、C2c4结构域、C2c5结构域、C2c8结构域、C2c9结构域、C2c10结构域、Cas14a结构域、Cas14b结构域和/或Cas14c结构域，或者，II型CRISPR
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Cas效应蛋白是Cas9结构域。33.根据权利要求32所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白是包含R1138A突变的LbCas12a切口酶(参见参考核苷酸序列SEQ ID NO:9)、包含R1226A突变的AsCas12a切口酶
(参见参考核苷酸序列SEQ ID NO:2)、包含R1228A突变的FnCas12a(参见参考核苷酸序列SEQ ID NO:6)或包含R1241A突变的PdCas12a切口酶(参见参考核苷酸序列SEQ ID NO:14)。34.根据权利要求1至29或31至33中任一项所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白包含降低的单链DNA切割活性(单链DNA酶活性)或被修饰(被突变)以降低(或消除)单链DNA酶活性。35.根据权利要求1至29或31至34中任一项所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白被修饰(被突变)以降低(或消除)自加工RNA酶活性，任选地其中突变是参考SEQ ID NO:9的核苷酸位置编号的H759A。36.根据权利要求1至29或31至35中任一项所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白被修饰以降低或消除核酸酶活性(例如，在核酸酶活性位点中(例如，在RuvC结构域中)的突变)，或II型CRISPR
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Cas效应蛋白被修饰以降低或消除核酸酶活性(例如，在核酸酶活性位点中(例如，在RuvC或HNH结构域中)的突变)，以产生失活的V型CRISPR
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Cas效应蛋白或失活的II型CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，deadCas(dCas、dCas12a、dCas9))。37.根据权利要求36所述的方法，其中失活的V型CRISPR
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Cas效应蛋白或失活的II型CRISPR
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Cas效应蛋白包含切口酶活性。38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中失活的V型CRISPR
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Cas效应蛋白或失活的II型CRISPR
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Cas效应蛋白融合至切口酶(例如，Fok1、BFi1，例如，工程改造的Fok1或BFiI)。39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V型CRISPR
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Cas效应蛋白是V型CRISPR
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Cas融合蛋白，其包含融合至逆转录酶的V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域，或者，II型CRISPR
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Cas效应蛋白是II型CRISPR
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Cas融合蛋白，其包含融合至逆转录酶的II型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域。40.根据权利要求39所述的方法，其中逆转录酶融合至V型CRISPR
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Cas效应多肽或II型CRISPR
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Cas效应多肽的C端。41.根据权利要求40所述的方法，其中逆转录酶融合至V型CRISPR
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Cas效应多肽或II型CRISPR
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Cas效应多肽的N端。42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中逆转录酶融合至一个或多个单链RNA结合结构域(RBD)，从而改善逆转录酶的热稳定性、可加工性和模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：成对植物服务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：