一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法技术

本发明专利技术涉及一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法，本发明专利技术采用ECL最大辐射波长位于485 nm的纳米金簇(Au NCs)和ECL最大辐射波长位于775 nm的铜铟硫量子点(CIS@ZnS NCs)为标记物，构建了光谱分辨型双色双组分ECL传感器，实现了蛋白CEA和核酸p53的同时检测，突破了已报道的ECL多组分传感器仅能够实现多种蛋白或多种核酸片段检测的局限性，同时有效避免了耗时的DNA扩增过程。的DNA扩增过程。的DNA扩增过程。

【技术实现步骤摘要】
一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法


[0001]本专利技术涉及一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法，属于电化学发光分析


技术介绍

[0002]高传染性新冠病毒 (SARS
‑
CoV
‑
2) 已呈全球流行趋势的背景下，快速检出病毒株对于及时隔离感染个体、阻断病毒传播具有重要的价值。核酸检测是新冠病毒诊断的金标准。核酸检测通常基于等温聚合酶链式反应 (RT
‑
PCR) 扩增和环介导等温扩增 (RT
‑
LAMP) 方式实现，具有装备要求复杂、检测耗时长，病毒突变影响检测结果准确性等不足之处。学术界和产业界开始将免疫分析引入新冠病毒检测领域，将抗原与抗体检测作为诊断新冠病毒感染的辅助与补充诊断手段，应用于聚集性疫情溯源。尽管核酸检测与免疫分析的联合使用对于阻断病毒扩散具有重要价值，学术界和产业界尚无同步实施核酸检测与免疫分析的配套多组分分析技术。
[0003]电化学发光 (ECL) 体外诊断技术具有灵敏度高、装置简单的显著特点，为避免核酸检测的繁琐扩增程序提供了潜在可行性。ECL多组分分析技术的发展已经使得同时检测两种抗原或核酸片段成为可能。He构建的波段识别型双组分ECL传感器实现了野生型p53和突变型p53两种核酸的同时检测 (Anal. Chem.2018, 90, 5474
−
5480)；Zhang构建的波段识别型双组分ECL免疫传感器实现了AFP和CA125两种蛋白的同时检测 (Biosens.
ꢁ
Bioelectron.2018, 115, 77
−
82)。中国专利文献CN106124487A提供了一种基于光谱分辨原理的ECL三组分免疫传感器，以CdSe量子点和CdTe量子点为标记物，实现三种抗原的同时检测。
[0004]迄今为止，波段识别型与光谱分辨型ECL多组分分析主要基于II
‑
VI族纳米材料实施，且均无法同步实施特定抗原与核酸片段的同步检测。能够同步实施免疫分析与核酸检测的ECL分析方法尚处于空白状态。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，尤其是尚无法基于光谱分辨原理实施特定抗原与核酸片段的同步检测的现状，本专利技术提供一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法。
[0006]本专利技术采用ECL最大辐射波长位于485 nm的水溶性金纳米簇 (Au NCs) 和ECL最大辐射波长位于775 nm的水溶性铜铟硫量子点 (CIS@ZnS NCs) 为标记物，构建了双色双组分光谱分辨型ECL传感器，实现了蛋白CEA和核酸p53的同步检测，突破了已报道的多组分ECL传感器难以同步实施核酸检测与免疫分析的局限性，同时有效避免了耗时的DNA扩增过程。
[0007]术语说明：
一抗（CEA
‑
Ab1）：本专利技术所述的一抗（Ab1）指癌胚抗原 (CEA) 的对应抗体，本专利技术对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
[0008]二抗（CEA
‑
Ab2）：本专利技术所述的二抗指CEA抗原和一抗的对应二抗。
[0009]目标DNA（T
p53
）：本专利技术所述的目标DNA指特定基因(单链)。
[0010]捕获DNA（C
p53
）：本专利技术所述的捕获DNA指上述特定基因某一片段的一条互补链，并且标记有巯基。
[0011]探针DNA（P
p53
）：本专利技术所述的探针DNA指上述特定基因某一片段的一条互补链，并标记有氨基，且其核苷酸序列与捕获DNA不同。
[0012]本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种基于光谱分辨原理同步实施ECL免疫分析和核酸检测的多组分分析方法，包括步骤如下：1）构建用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器，所述ECL多组分分析传感器的最大辐射波长分别位于485和775 nm；包括金纳米簇标记的第二抗体（Ab2|Au NCs）与铜铟硫量子点标记的探针DNA片段（P
p53
|CIS@ZnS NCs）、CEA
‑
Ag与T
p53
以及Au|MPA
‑
Ab1与Au|MPA
‑
C
p53
，基于免疫与核酸反应的选择性构建成ECL多组分分析传感器：。
[0013]2）以ECL多组分分析传感器为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含5
‑
20 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；3）以曝光成像方式收集ECL全过程的所有光子，基于色散ECL辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长485 nm处的最大辐射强度与标准抗原溶液浓度之间的关系，绘制CEA检测工作曲线；依据光谱曲线上最大辐射波长775 nm处的最大辐射强度与T
p53
浓度之间的关系，绘制T
p53
检测工作曲线。
[0014]4）将待测样品按步骤1）构建免疫核酸同步检测的ECL传感器，按步骤2）和步骤3）中的方法进行ECL光谱测试，根据所得ECL光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线，同步检测待测样品溶液中的抗原和目标DNA的浓度。
[0015]根据本专利技术优选的，步骤2）、步骤4），执行循环伏安法扫描时，扫描电压范围为0 ~ 1.6 V，扫描圈数1 ~ 3圈，扫描速度为40 ~ 60 mV/s。采用循环伏安法驱动固定于工作电极表面的Au NCs和CIS@ZnS NCs分别产生相应的ECL辐射。
[0016]根据本专利技术优选的，步骤1）中，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建方法如下：a、以清洁活化后的Au电极为工作电极，将CEA
‑
Ab1和C
p53
同时标记在电极表面，得到双标记Au电极；b、水溶性Au NCs标记CEA
‑
Ab2，得到Ab2|Au NCs；水溶性CIS@ZnS NCs标记探针DNA，得到P
p53
|CIS@ZnS NCs；c、将CEA
‑
Ag和T
p53
滴加到双标记Au电极表面，室温孵育，再将步骤b得到的Ab2|Au NCs和P
p53
|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育；以形成免疫复合物的形式将Ab2|Au NCs和P
p53
|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，得到用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器。
[0017]根据本专利技术优选的，上述步骤a中，双标记Au电极的制备步骤如下：（1）将清洁的Au电极在5
‑
20 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于光谱分辨原理同步实施ECL免疫分析和核酸检测的多组分分析方法，包括步骤如下：1）构建用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器，所述ECL多组分分析传感器的最大辐射波长分别位于485和775 nm；包括金纳米簇标记的第二抗体（Ab2|Au NCs）与铜铟硫量子点标记的探针DNA片段（P
p53
|CIS@ZnS NCs）、CEA
‑
Ag与T
p53
以及Au|MPA
‑
Ab1与Au|MPA
‑
C
p53
，基于免疫与核酸反应的选择性构建成ECL多组分分析传感器：；2）以ECL多组分分析传感器为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含5
‑
20 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；3）以曝光成像方式收集ECL全过程的所有光子，基于色散ECL辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长485 nm处的最大辐射强度与标准抗原溶液浓度之间的关系，绘制CEA检测工作曲线；依据光谱曲线上最大辐射波长775 nm处的最大辐射强度与T
p53
浓度之间的关系，绘制T
p53
检测工作曲线；4）将待测样品按步骤1）构建免疫核酸同步检测的ECL传感器，按步骤2）和步骤3）中的方法进行ECL光谱测试，根据所得ECL光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线，同步检测待测样品溶液中的抗原和目标DNA的浓度。2.根据权利要求1所述的多组分分析方法，其特征在于，步骤2）、步骤4），执行循环伏安法扫描时，扫描电压范围为0 ~ 1.6 V，扫描圈数1 ~ 3圈，扫描速度为40 ~ 60 mV/s。3.根据权利要求1所述的多组分分析方法，其特征在于，步骤1）中，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建方法如下：a、以清洁活化后的Au电极为工作电极，将CEA
‑
Ab1和C
p53
同时标记在电极表面，得到双标记Au电极；b、水溶性Au NCs标记CEA
‑
Ab2，得到Ab2|Au NCs；水溶性CIS@ZnS NCs标记探针DNA，得到P
p53
|CIS@ZnS NCs；c、将CEA
‑
Ag和T
p53
滴加到双标记Au电极表面，室温孵育，再将步骤b得到的Ab2|Au NCs和P
p53
|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育；以形成免疫复合物的形式将Ab2|Au NCs和P
p53
|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，得到用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器。4.根据权利要求3所述的多组分分析方法，其特征在于，步骤a中，双标记Au电极的制备步骤如下：（1）将清洁的Au电极在5
‑
20 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au
‑
S键将MPA键合到电极表面；（2）向步骤（1）所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL 1
‑
乙基
‑
（3
‑
二甲基氨基丙酸）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10 mg/mL羟基琥珀酰亚胺（NHS），活化30 min，清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；（3）将CEA
‑
Ab1水溶液和C
p53
水溶液混合后滴加到活化电极表面，孵育2
‑
4 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极，得到双标记Au电极；CEA
‑
Ab1水溶液的浓度为8
‑
15 μg/mL，滴加量为8
‑
15 μL，C
p53
水溶液的浓度为8
‑
15 μM，滴加量为8
‑
15 μL。
5.根据权利要求3所述的多组分分析方法，其特征在于，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建步骤b中， 所述Ab2|Au NCs的合成步骤如下：1）活化水溶性Au NCs表面的羧酸基团；2）使第二抗体与经过步骤1）处理的水溶性Au NCs表面的羧酸基团反应，获得水溶性Au NCs标记的抗原对应的第二抗体；优选的，所述Ab2|Au NCs具体制备步骤如下：将纯化后的Au NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 M pH 6.0磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的Au NCs；加入8
‑
15 μL浓度为8
‑
15 μg/mL CEA
‑
Ab2水溶液，37 ℃下恒温孵育3
‑
5 h，加入20 μL牛血清蛋白（BSA）封闭30 min，离心收集沉淀，得到Ab2|Au NCs。6.根据权利要求5所述的多组分分析方法，其特征在于，水溶性Au NCs是以氯金酸为金源，巯基丙酸为稳定剂，乙酸锌为聚集诱导体制得；优选的，水溶性Au NCs的合成步骤为：（1）取35.5 μL 100 mg/mL 的HAuCl4∙
3H2O，加入2.5 mL去离子水；（2）向步骤（1）中加入50 μL 巯基丙酸，搅拌15 min；（3）向步骤（2）中加入430 μL 1 M 氢氧化钠，调节pH至8.5；（4）向步骤（3）中加入0.5 mL 0.1 M 乙酸锌，室温搅拌反应6 h，反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，得到水溶性Au NCs。7.根据权利要求3所述的多组分分析方法，其特征在于，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建步骤b中，所述P
p53
|CIS@ZnS NCs的合成步骤如下：1）活化水溶性CIS@ZnS NCs表面的羧酸基团；2）使P
p53
与活化后水溶性CIS@ZnS NCs表面的羧酸基团反应，获得水溶性CIS@ZnS NCs标记的目标DNA对应的探针DNA；优选的，所述P
p53
|CIS@ZnS NCs具体制备步骤如下：将纯化后的CIS@ZnS NCs...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹桂征，高旭雯，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：