一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品及其制备方法，属于生物制品技术领域。合成高危型(HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82)，低危型(HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81、HPV83)25种分型HPV全基因组后，连入pcDNA3.1(+)骨架载体系统，将HPV全基因组分别整合到人卵巢癌细胞系ovcar3基因组中，获得25株稳定整合HPV全基因组的人卵巢癌细胞系。可制备基因组DNA、细胞沉淀、细胞悬液等各类模拟临床样品的新型质控品或试剂盒，适用于多种检测平台。为25种HPV分型全长基因组稳定整合的人源细胞系质控品，能更准确的测定病毒载量，质控HPV检测全流程。质控HPV检测全流程。质控HPV检测全流程。

【技术实现步骤摘要】
一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物制品
，具体地说，涉及一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品及其制备方法。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)属于乳头瘤病毒科，是一种无被膜包被的环状双链DNA病毒，由DNA核心和蛋白衣壳组成，衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。基因组全长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区，编码e1、e2、e4、e5、e6、e7等早期蛋白，参与病毒的复制、转录、翻译调控和转化等功能)、晚期转录区(L区，编码衣壳蛋白L1和L2)和非转录区(长控制区，LCR，含有dna的复制起点和表达所需的调控元件，调控病毒的转录与复制)。已报道HPV超过200种，可通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。根据HPV感染后危害性，将其分为高危型(HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82)，低危型(HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81、HPV83)以及其他亚型。流行病学研究显示，高危型HPV在人体正常宫颈上皮细胞中持续感染是宫颈癌、直肠癌发生的主要诱因之一，低危型与寻常疣、扁平疣、跖疣等相关。
[0003]HPV早期检测尤其是精确分型对宫颈癌的早期发现、预防、预警和治疗极为关键。临床检测HPV主要是基于病毒核酸检测，具体方法有PCR
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反向点杂交法、PCR
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荧光探针法、PC R
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导流杂交法杂交捕获
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化学发光法等。检测试剂种类较多，具有不同的原理和特点，分析灵敏性、特异性等性能指标也各有差异。为了提高实验室及不同试剂盒检测结果的可靠性及一致性，应当开展实验室间的室间质量评价，对实验室HPV检测或者基因分型的结果进行比对，监控不同平台及实验室检测能力，提高结果报告准确性。
[0004]校准品(物)、质控品(物)是实现体外诊断临床检测及监督检验结果准确一致的主要工具，也是保证量值传递的实物计量标准。HPV国际标准物质为利用人宫颈细胞系提取的HPV阴性的基因组DNA稀释重组HPV基因组质粒而成。同时，目前市面上HPV质控品也均为质粒来源，部分用质粒加入人源基因组稀释得来。此类标准品不能监控样品处理流程，同时与临床样品存在较大的基质差异，形式单一。其次，在临床检测中，HPV病毒载量是评价宫颈病变程度重要参考指标，更近一步反应真实病毒感染程度。(HPV病毒载量即：单位感染上皮细胞中HPV的拷贝数)。研究表明，HPV的不同基因分型和病毒载量是CIN2+和CI N3+的重要预测因子。根据HPV基因型和病毒载量来识别具有较高CIN2+和CIN3+风险的患者，这对于制定个体化的分诊及随访策略很重要。而以质粒形式制备的质控品并不具备检测病毒载量的能力。

技术实现思路

[0005]1、要解决的问题
[0006]针对以上标准品/质控品在实际使用场景下的局限性，本专利技术提出一种新型质控
品，为25种HPV分型全长基因组稳定整合的人源细胞系质控品，能更准确的测定病毒载量，质控HPV检测全流程；同时HPV分型制备的质控品及试剂盒，能够制备成gDNA、细胞沉淀、细胞悬液等多种形式，适用于多种检测平台。
[0007]2、技术方案
[0008]为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。
[0009]一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，所述的质控品为含有HPV全基因组的人卵巢癌细胞系制备的质控品。
[0010]上述所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品中，
[0011]所述的含有HPV全基因组的人卵巢癌细胞系为通过将HPV全基因组整合到人卵巢癌细胞系ovcar3基因组中而获得。
[0012]上述所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品中，
[0013]所述的HPV全基因组连入pcDNA3.1(+)骨架载体系统。
[0014]上述所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品中，
[0015]所述的HPV全基因组包括高危型HPV全基因组与低危型HPV全基因组。
[0016]上述所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品中，
[0017]所述的高危型HPV全基因组包括HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82。
[0018]上述所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品中，
[0019]所述的低危型HPV全基因组包括HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81、HPV83。
[0020]上述所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品中，
[0021]所述的质控品包括基因组DNA、细胞沉淀、细胞悬液。
[0022]一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品的制备方法，包括以下步骤：
[0023](1)HPV基因组序列的合成；
[0024](2)HPV质粒的转染；
[0025](3)HPV单克隆筛选及鉴定；
[0026](4)HPV不同拷贝数梯度质控品制备。
[0027]上述所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品的制备方法中，
[0028]步骤(1)中HPV基因组序列的两端添加酶切位点，其中5
’
端的酶切位点为NheI，其中3
’
端的酶切位点为PmeI；
[0029]步骤(2)中转染的方式如下：
[0030]通过酶切位点NheI、酶切位点PmeI分别连入pcDNA3.1(+)骨架载体，获得25种HPV分型质粒HPVx
‑
pcDNA3.1(+)，其中x表示具体HPV分型；将上述25种质粒分别转染ovcar3细胞，转染体系配置如下：
[0031]buffer：75μL，
[0032]HPVx
‑
pcDNA3.1(+)：1μg，
[0033]reagent：3.6μL，
[0034]将上述配置体系混匀，置于室温下静置10min，混匀后的体系加入提前接种ovcar3细胞系的12孔板中，培养箱中孵育4h
‑
6h后更换正常培养基。
[0035]上述所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品的制备方法中，
[0036]步骤(3)中单克隆筛选及鉴定的具体方法如下：
[0037]转染后24h，将细胞培养基换成包含抗生素的G418培养基，进行细胞的筛选；筛选结束后，将剩余的细胞进行单细胞克隆，消化并收集细胞、按照倍比稀释的方法，对细胞准确计数，用培养基将活细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：所述的质控品为含有HPV全基因组的人卵巢癌细胞系制备的质控品。2.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：所述的含有HPV全基因组的人卵巢癌细胞系为通过将HPV全基因组整合到人卵巢癌细胞系ovcar3基因组中而获得。3.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：所述的HPV全基因组连入pcDNA3.1(+)骨架载体系统。4.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：所述的HPV全基因组包括高危型HPV全基因组与低危型HPV全基因组。5.根据权利要求4所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：所述的高危型HPV全基因组包括HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82。6.根据权利要求4所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：所述的低危型HPV全基因组包括HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81、HPV83。7.根据权利要求1所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品，其特征在于：所述的质控品包括基因组DNA、细胞沉淀、细胞悬液。8.一种用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品的制备方法，包括以下步骤：(1)HPV基因组序列的合成；(2)HPV质粒的转染；(3)HPV单克隆筛选及鉴定；(4)HPV不同拷贝数梯度质控品制备。9.根据权利要求8所述的用于人乳头瘤病毒分子检测的质控品的制备方法，其特征在于：步骤(1)中HPV基因组序列的两端添加酶切位点，其中5
’
端的酶切位点为NheI，其中3
’
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【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：菁良基因科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：