一种嗜热链球菌重组菌的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种嗜热链球菌重组菌的构建方法及应用，主要为敲除嗜热链球菌的乳糖透过酶基因，得到嗜热链球菌ΔlacS，将含有大肠杆菌半乳糖转运酶片段基因的载体pNZ8148

【技术实现步骤摘要】
一种嗜热链球菌重组菌的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种嗜热链球菌重组菌的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]酸奶因其营养价值高、风味独特以及良好的保健效果，成为当今世界广泛流行的发酵乳制品。国际乳品联合会、世界卫生组织和联合国粮农组织于1997年将酸奶定义如下：在添加或不添加乳粉或脱脂乳粉的杀菌乳或浓缩乳中，通过接种商业化的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行发酵而成的凝乳状产品，成品中必须含有一定量的活菌。
[0003]嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌对乳糖的代谢过程基本相同。乳糖通过乳糖透过酶LacS进入细胞，随后在胞内β
‑
半乳糖苷酶LacZ的作用下水解为葡萄糖和半乳糖。其中，葡萄糖进入糖酵解途径，半乳糖因不被利用而排至细胞外。对于半乳糖的代谢，保加利亚乳杆菌缺乏编码Leloir途径所需酶的完整基因，而绝大多数的嗜热链球菌，虽然具有编码Leloir途径所需酶的完整基因galKTEM，但是仍然无法代谢半乳糖。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌代谢半乳糖缺陷导致酸奶中残留大量的半乳糖。这不仅会降低发酵产物的品质，如高浓度的半乳糖会导致奶酪在加热过程中发生褐变，残留的半乳糖还会被异源发酵剂利用而生成二氧化碳，导致乳酪裂口、断裂等组织缺陷。乳品中残留的半乳糖还限制了半乳糖血症患者的食用。也有少数嗜热链球菌菌株在利用乳糖的同时能够代谢半乳糖。
[0004]中国专利文献CN111254106A(申请号：202010229538.5)公开了一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用，该专利文献公开的食品级嗜热链球菌表达系统包含食品级宿主嗜热链球菌CN3070、食品级表达载体pST5240；所述食品级宿主嗜热链球菌JIM8232基因组上的乳糖转运酶STlacS基因而获得，丧失利用乳糖的能力，食品表达载体pS5240包括来自植物乳杆菌的乳糖转运酶LPlacS基因作为筛选标记，将食品表达载体pS5240转化入嗜热链球菌CH3070，可以在只含有乳糖为碳源的LM17培养基中生长，可以利用乳糖；与本专利技术提供嗜热链球菌重组菌有明显区别。
[0005]现有技术中，针对只利用半乳糖而不利于乳糖的嗜热链球菌没有报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种嗜热链球菌重组菌的构建方法及应用。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种嗜热链球菌重组菌的构建方法，具体如下步骤：
[0009](1)一株嗜热链球菌ΔlacS的构建，包括如下步骤：
[0010]①
提取嗜热链球菌DSM 32596(Streptococcus thermophilus DSM 32596)的基因组DNA；
[0011]②
以步骤
①
的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对ST
‑
LacS
‑
up
‑
F和ST
‑
LacS
‑
up
‑
R进行PCR扩增乳糖透过酶基因的上游同源臂，利用
核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对ST
‑
LacS
‑
down
‑
F和ST
‑
LacS
‑
down
‑
R进行PCR扩增乳糖透过酶基因的下游同源臂，然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得乳糖透过酶基因敲除连接臂；
[0012]ST
‑
LacS
‑
up
‑
F:
[0013]ggtaccgggccccccctcgagTTCCAACGGAAACTGGTGCT SEQ ID NO.1；
[0014]ST
‑
LacS
‑
up
‑
R:
[0015]TTCGGAAACCTCCTATTATTTG SEQ ID NO.2；
[0016]ST
‑
LacS
‑
down
‑
F:
[0017]CAAATAATAGGAGGTTTCCGAATCTATGAACATGACTGAAAAAAT SEQ ID NO.3；
[0018]ST
‑
LacS
‑
down
‑
R:
[0019]agtggatcccccgggctgcagAAGACAATTCTCTTACCATTC SEQ ID NO.4。
[0020]③
使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤
②
中，制得的乳糖透过酶基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL
‑
Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
[0021]④
将步骤
③
得到的重组质粒转化入嗜热链球菌DSM 32596中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对，对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3085bp的目的产物，即为乳糖透过酶基因敲除菌株，命名为嗜热链球菌ΔlacS；
[0022]ST
‑
LacS
‑
test
‑
F:TCGTGACTATGTGCATCC
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
SEQ ID NO.5；
[0023]ST
‑
LacS
‑
test
‑
R:GATATCAGCTGGTTTCGC
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
SEQ ID NO.6。
[0024](2)将载体pNZ8148
‑
E
‑
gala转化入嗜热链球菌ΔlacS中，所述载体pNZ8148
‑
E
‑
gala的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0025]根据本专利技术优选的，步骤
②
中，上游同源臂PCR扩增体系如下：Ex taq buffer 25μL，dNTP4μL，引物ST
‑
LacS
‑
up
‑
F 2μL，引物ST
‑
LacS
‑
up
‑
R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；
[0026]PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嗜热链球菌重组菌的构建方法，其特征在于，具体如下步骤：(1)一株嗜热链球菌ΔlacS的构建，包括如下步骤：
①
提取嗜热链球菌DSM 32596(Streptococcus thermophilus DSM 32596)的基因组DNA；
②
以步骤
①
的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对ST
‑
LacS
‑
up
‑
F和ST
‑
LacS
‑
up
‑
R进行PCR扩增乳糖透过酶基因的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对ST
‑
LacS
‑
down
‑
F和ST
‑
LacS
‑
down
‑
R进行PCR扩增乳糖透过酶基因的下游同源臂，然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得乳糖透过酶基因敲除连接臂；
③
使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤
②
中，制得的乳糖透过酶基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL
‑
Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
④
将步骤
③
得到的重组质粒转化入嗜热链球菌DSM 32596中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对，对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3085bp的目的产物，即为乳糖透过酶基因敲除菌株，命名为嗜热链球菌ΔlacS；(2)将载体pNZ8148
‑
E
‑
gala转化入嗜热链球菌ΔlacS中，所述载体pNZ8148
‑
E
‑
gala的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤
②
中，上游同源臂PCR扩增体系如下：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物ST
‑
LacS
‑
up
‑
F 2μL，引物ST
‑
LacS
‑
up
‑
R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；步骤
②
中，下游同源臂PCR扩增体系如下：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物ST
‑
LacS
‑
down
‑
F 2μL，引物ST
‑
LacS
‑
down
‑
R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；步骤
②
中，上游同源臂和下游同源臂进行连接，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物ST
‑
LacS
‑
up
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F 2μL，引物ST
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LacS
‑
down
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R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL，双蒸水12μL；PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。3.如权利要求1所述的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振上，王婷，张夙夙，严梦远，梁琰，刘新利，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：