一种丙氨酰美登醇及其合成方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种丙氨酰美登醇及其合成方法和应用。本发明专利技术截取了基因astC中编码A

【技术实现步骤摘要】
一种丙氨酰美登醇及其合成方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种丙氨酰美登醇及其合成方法和应用，属于天然药物化学与医药应用


技术介绍

[0002]美登木素属于安莎类大环内酰胺，根据其来源可分为植物美登木素和细菌美登木素两大类。两类美登木素具有相同的骨架和相似的后修饰基团，都有极强的抗菌和抗肿瘤活性。研究发现美登木素衍生物可以结合微管蛋白β亚基，阻止微管束聚集形成，破坏有丝分裂过程，从而抑制肿瘤细胞生长。由于存在神经毒性，美登木素衍生物不能直接用于临床，但可以作为“弹头”与特异免疫蛋白偶联制备成抗体药物偶联物，特异性识别肿瘤细胞表面的抗原表位，避免对正常细胞的杀伤，相比于一般化疗药物具有更优越的安全性和耐受性。2013年，FDA 批准了美登木素抗体药物偶联物ado
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trastuzumab emtansine(T
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DM1)的上市，应用于人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌的临床治疗。目前，与T
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DM1相关的临床研究均证实其在 HER2阳性乳腺癌治疗中具有卓越的疗效。
[0003]丙氨酰美登醇衍生物是T
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DM1“弹头”的重要中间体，是以细菌美登木素为原料通过化学合成制备的。由于细菌美登木素原始结构中并没有合适的偶联的位点，化学方法需要通过还原反应脱去细菌美登木素C
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3位酯基，然后再选择性丙氨酰化，不但成本高、产率低，还有不易分离除去的副产物，造成昂贵原料的浪费，是导致T
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DM1价格高昂的重要因素之一。
[0004]非核糖体多肽合酶AstC由三个结构域(adenylation
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thiolation
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thioesterase,A
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T
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TE)组成，可以使用细菌美登木素为氨基受体，在其C
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3位羟基上加入丙氨酰基，然后通过异源表达非核糖体多肽合酶基因astC可以产生C
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3位为丙氨酰基的化合物，但通过非核糖体多肽合酶AstC制备丙氨酰美登醇的产量很低，导致合成美登木素抗体偶联物的中间产物成本很高，严重阻碍美登木素抗体偶联物药物的研究、生产和临床应用。
[0005]研究表明AstC的TE结构域负责氨基受体的选择，而细菌美登木素不是AstC的天然底物，因此寻找可以高效识别细菌美登木素的非核糖体多肽合酶或TE结构域是丙氨酰美登醇高产的关键。

技术实现思路

[0006]对美登木素衍生物抗肿瘤构效关系的研究发现，C
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3位酯基侧链对其抗肿瘤活性起关键作用(Chem Pharm Bull 2004,52,1
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26)，用于制备美登木素抗体偶联物的是C
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3位为丙氨酰基的美登醇衍生物。虽然异源表达非核糖体多肽合酶基因astC可以产生C
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3位为丙氨酰基的化合物，但产量极低。根据目前的假说，植物内生菌可能是植物美登木素的真正生产者。对产美登木素植物Mallotus nudiflorus L的茎皮内生菌宏基因组进行分析，发现了可能负责美登木素丙氨酰化的非核糖体多肽合酶基因片段contig_44136，该片段编码T
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TE两个结构域，缺少 A结构域，无法独立参与丙氨酰化反应。
pSBT11
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nrps；
[0025](d)将质粒载体pSBT11
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nrps转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，获得大肠杆菌
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放线菌接合转移供体菌ET12567/pUZ8002/pSBT11
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nrps；
[0026](e)将供体菌ET12567/pUZ8002/pSBT11
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nrps与珍贵橙色束丝放线菌突变株 HGF052+pJTU824
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asm18的菌丝体进行接合转移，得到基因工程菌 HGF052+pJTU824
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asm18+pSBT11
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nrps。
[0027]进一步优选的，步骤(a)中，所述非核糖体多肽合酶基因astC基因库登记号为KF813023.1，所述基因astC中编码A
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T结构域的DNA片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0028]进一步优选的，步骤(b)中，所述人工合成基因contig_44136的序列如SEQ ID NO.4 所示；所述基因contig_44136中编码TE结构域的DNA片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0029]进一步优选的，步骤(c)中，所述整合型表达载体pSBT11来自文献Li,X.,et al.(2019). "Identification of the bacterial maytansinoid gene cluster asc provides insights into the post
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PKSmodifications of ansacarbamitocin biosynthesis."Organic Letters 21(15):5823
‑
5826。
[0030]进一步优选的，步骤(c)中，所述杂合基因nrps序列如SEQ ID NO.3所示。
[0031]进一步优选的，步骤(e)中，所述HGF052+pJTU824
‑
asm18菌株来自文献Appl Microbiol Biotechnol 2016，100，2641
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2649。
[0032]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述发酵培养条件为在28℃下培养10天，所述YMG 固体培养基成分以质量百分比计为：0.4％葡萄糖、1％麦芽提取物、0.4％酵母提取物、2％琼脂粉和96.2％蒸馏水。
[0033]根据本专利技术优选的，步骤(4)中，所述提取采用的甲醇为90～95％甲醇。
[0034]根据本专利技术优选的，步骤(5)中，所述反相硅胶柱填料为C
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18，凝胶柱型号为SephadexLH
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20，正相硅胶柱填料为200～300目。
[0035]根据本专利技术优选的，步骤(5)中，所述对甲醇提取物进行分离的具体步骤为：
[0036]甲醇提取物首先经反相硅胶柱层析分离，分别用水、40％、60％、80％、100％甲醇依次洗脱，每个组分洗脱1L，200～250mL/份接收，TLC检测，用CH2Cl2:MeOH＝15:1(v/v)展开，用浓硫酸和碘化铋钾显色，合并60％洗脱组分；继续用凝胶柱层析分离，甲醇洗脱，3～5 mL/管，合并33～38管；继续正相硅胶柱层析分离，最后用体积比为100:1、80:1、50:1的 CH2Cl2/MeOH溶液洗脱，合并80:1洗脱成分，得到丙氨酰美登醇。
[0037]经药理试验研究表明，本专利技术提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丙氨酰美登醇，其化学结构如下所示：2.如权利要求1所述丙氨酰美登醇的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将能够表达非核糖体多肽合酶的基因工程菌HGF052+pJTU824
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asm18+pSBT11
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nrps在28～30℃下，使用YMG固体培养基发酵培养10～14天，得到固体培养物；(2)将固体培养物切成1cm见方的小块，在20～30℃下用体积比为80:15:5的乙酸乙酯/甲醇/甲酸浸泡提取三次，合并提取液，减压及35～40℃的温度下浓缩至干，得粗提物；(3)将粗提物溶于水中，使用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相减压及35～40℃的温度下浓缩至干，得EA提取物；(4)将EA提取物溶于甲醇中，再经石油醚多次萃取，甲醇相减压及35～40℃的温度下浓缩至干，得甲醇提取物；(5)将甲醇提取物依次经反相硅胶柱层析分离，凝胶柱层析分离，薄层层析和正相硅胶柱层析分离，然后将组分相同的洗脱液进行合并，得到丙氨酰美登醇。3.如权利要求2所述丙氨酰美登醇的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基因工程菌HGF052+pJTU824
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asm18+pSBT11
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nrps的构建方法，包括步骤如下：(a)以非核糖体多肽合酶基因astC为模板进行PCR扩增，扩增得到基因astC中编码A
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T结构域的DNA片段，PCR引物序列如下：astC
‑
F:5
′‑
AAAGGAGGCGGACATATGGAGACGAACATGCTGGTGCAGG
‑3′
，astC
‑
R:5
′‑
CGACCCACGGAGGTCGAAGAAGCTGTCGCGCGGACCGACC
‑3′
；(b)以人工合成基因contig_44136为模板进行PCR扩增，扩增得到基因contig_44136中编码TE结构域的DNA片段，PCR引物序列如下：44136
‑
F:5
′‑
CGCGACAGCTTCTTCGACCTCCGTGGGTCGGACGTGCTCG
‑3′
，44136
‑
R:5
′‑
GACATGATTACGAATTCAGGGCCGGGTCGGGTCCGTCCCG
‑3′
；(c)将步骤(1)中所述编码A
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T结构域的DNA片段和步骤(2)中所述编码TE结构域的DNA片段顺序插入到整合型表达载体pSBT11上的Ned I和EcoR I限制性酶切位点之间，形成杂合基因nrps，所述杂合基因nrps位于ermE*启动子的下游并受其调控，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月毛，李小曼，赵生亮，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：