黄河鲤抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄河鲤抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其应用，克隆黄河鲤抗菌肽hepcidin基因全长cDNA序列，扩增出基因片段，构建到毕赤酵母表达载体pPICZα A，得到重组表达载体，重组载体电转至毕赤酵母X

【技术实现步骤摘要】
黄河鲤抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种黄河鲤抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其应用。

技术介绍

[0002]鱼类抗菌肽Hepcidin，是一种具有抗菌活性的防御素类的小肽，还可参与调节铁代谢。在近20年，Hepcidin在硬骨鱼类中的基因序列、分子结构和生物学功能的研究已被广泛报道。Shike等研究了Hepcidin在几种不同物种中的序列和分子结构，发现Hepcidin的基因组结构在硬骨鱼中高度保守，包含三个由两个内含子分隔的外显子。这三个外显子编码高度保守的信号肽、前体肽和成熟肽组成的前肽。信号肽含有24个氨基酸，具有抗菌功能。不同物种的Hepcidin蛋白具有高度保守的基序，在前体肽含有典型的RX（K/R）R序列，用于招募前肽转化酶形成由19
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31个氨基酸组成的成熟肽。从鱼类到哺乳动物的Hepcidin成熟肽序列显示，在成熟肽中发现的8个半胱氨酸残基具有高度保守性，这些半胱氨酸残基通常形成四个分子内二硫键，其中一个相邻的二硫键桥形成发卡结构有助于Hepcidin折叠成亲水和疏水侧链，是Hepcidin发挥抗菌活性的关键。
[0003]鱼类Hepcidin既是一种铁稳态的调节剂，又是一种抗菌肽，可以通过调节铁代谢来发挥其抗菌功能。黄颡鱼Hepcidin的表达上调，能降低血清铁水平来抵抗维氏气单胞菌的感染。草鱼Hepcidin可以通过细胞铁转运蛋白的内化和降解阻止肝细胞系的铁释放，并抑制细胞外细菌对铁的使用，以抑制细菌生长。另外，在网箱养殖条件下，饲粮中添加不同剂量的草鱼重组Hepcidin，能够控制鱼体内铁的分布，从而防止细菌感染，具有保护作用。
[0004]鱼类Hepcidin除了通过调节铁代谢抑制细菌生长外，还具有直接杀伤细菌的作用。鱼类Hepcidin在体外对病原菌具有广泛的杀菌活性，如源自斑马鱼的Hepcidin
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2具有直接杀菌活性，能使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞表面破裂和细胞质变薄、透明。Huang等观察到棕色鳟鱼Hepcidin处理的嗜水气单胞菌细胞起皱并被破坏，这表明Hepcidin能破坏病原菌的细胞膜。大黄鱼Hepcidin处理的谷氨酸棒状杆菌和美人鱼发光杆菌菌体表面变得粗糙，并在处理2小时后形成蜂窝状结构，表明Hepcidin对细菌具有杀菌作用。在海鲈中，已经证明Hepcidin通过与某些细胞内靶点结合或与细菌膜结合而对鳗鲡弧菌的复制产生影响。鳟鱼中，Hepcidin通过其N
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末端的ATCUN金属结合基序促进细菌DNA水解。研究还证明鱼类Hepcidin在体内具有抗菌活性。与未经处理的受感染的对照鱼相比，事先在体内注射合成的大菱鲆Hepcidin蛋白，可以大大降低受感染鱼肾脏、脾脏和肝脏中的细菌数量。
[0005]鱼类Hepcidin还可以作为有效的免疫调节剂，诱导免疫相关因子形成，从而调节炎症反应。里海鳟鱼Hepcidin1通过诱导原代细胞中促炎细胞因子IL
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6、TNF
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α和MHC基因的表达来发挥免疫调节功能。在创伤弧菌感染转基因斑马鱼后，Hepcidin诱导IL
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10、IL
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26、溶菌酶、TLR
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4和Myd88的表达，从而有效抑制细菌生长。通过中华乌塘鳢对进行腹腔注射100μg合成的Hepcidin成熟肽，可以提高中华乌塘鳢感染副溶血性弧菌的存活率。
[0006]毕赤酵母真核表达系统能够进行许多真核生物翻译并修饰。Hepcidin含有4对二硫键，其特殊的结构使其很难以正确的折叠构型合成，采用毕赤酵母真核表达系统更有利于二硫键桥的形成，更容易获得大量具有活性的Hepcidin蛋白。由毕赤酵母真核表达的松江鲈Hepcidin蛋白具有模式识别功能和对多种细菌的凝集活性。毕赤酵母真核表达系统易于从摇瓶培养扩展到高密度发酵罐培养，因此更适合应用到工业上生产Hepcidin蛋白。因此我们选用了毕赤酵母表达系统来进行黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因的重组表达，并研究了重组Hepcidin蛋白的抗菌活性以及作为饲料添加剂对鱼类抗病能力的增强效果，为Hepcidin重组蛋白应用于生产实践奠定基础。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供了一种黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物及其应用，该黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、鳗弧菌、枯草芽孢杆菌有明显的抗菌功能，并且以120mg/kg的剂量添加到饲料中投喂，能显著提高黄河鲤感染嗜水气单胞菌后的存活率。
[0008]本专利技术为实现上述目的采用如下技术方案，黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因，该黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术所述黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物，其特征在于：该黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
[0010]进一步限定，该黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物为分子量10kDa的黄河鲤抗菌肽Hepcidin重组蛋白。
[0011]本专利技术所述黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤S1：表达质粒pPICZα A
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cchepcidin的构建，以黄河鲤hepcidin全长cDNA序列为模板，扩增其43位至第315位的共273bp的开放阅读框片段，并在片段两端引入酶切位点Xho I和Xba I，通过双酶切和T4连接酶将该片段构建到pPICZα A载体，重组载体经Sac
ꢀⅠ
酶线性化以后，电转化毕赤酵母X
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33，用含100μg/mL Zeocin的YPD平板筛选转化成功的菌体即重组酵母菌株，并且提取菌体DNA，通过PCR鉴定，确定Hepcidin基因已成功构建到pPICZα A载体。pPICZα A载体单独转染毕赤酵母X
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33作为对照菌株。
[0012]步骤S2：表达产物的诱导和浓度测定：重组酵母菌株接种于含100μg/mL Zeocin YPD液体培养基中活化，30℃震荡培养，而后接种到BMGY培养基中，培养至OD
600
至2.0左右，4℃、6000g离心7min，将菌体转入BMMY培养基中，30℃震荡培养；每隔24h添加甲醇诱导表达，且取样SDS
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PAGE检测是否表达，直到其达到最大表达量，将诱导表达好的菌液12000g，4℃离心，将表达上清液过0.45μm滤膜后用切向回流超滤器（赛多利斯VIVAFLOW 200）浓缩培养液上清。用同样的方法浓缩pPICZα A空载体毕赤酵母菌表达上清。用BCA蛋白浓度试剂盒测定重组毕赤酵母X
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33/pPICZα A
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ccHepcidin发酵上清总蛋白浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物，其特征在于：该黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物，其特征在于：该黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物为分子量10kDa的黄河鲤抗菌肽Hepcidin重组蛋白。3.一种权利要求1所述的黄河鲤抗菌肽Hepcidin基因酵母表达产物的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤S1：表达质粒pPICZα A
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cchepcidin的构建，以黄河鲤hepcidin全长cDNA序列为模板，扩增其43位至第315位的共273bp的开放阅读框片段，并在片段两端引入酶切位点Xho I和Xba I，通过双酶切和T4连接酶将该片段构建到pPICZα A载体，重组载体经Sac
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酶线性化以后，电转化毕赤酵母X
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33，用含100μg/mL Zeocin的YPD平板筛选转化成功的菌体即重组酵母菌株，并且提取菌体DNA，通过PCR鉴定，确定Hepcidin基因已成功构建到pPICZα A载体；步骤S2：表达产物的诱导，将重组酵母菌株接种于含100μg/mL Zeoci...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴超，孔祥会，颜研，乔丹，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：