一种扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法和分析方法技术

本发明专利技术涉及一种扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法和分析方法，制备方法包括：(1)利玛原甲藻培养生长；(2)利玛原甲藻OA和DTX1胞内外毒素预混液制备；(3)扇贝和利玛原甲藻混合匀浆基料的制备；(4)混合基料预冷冻；(5)真空冷冻干燥；(6)冻干粉研磨、过筛；(7)冻干细粉的干粉混匀和均质，得到扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品。所述扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品具有更好的均匀性、稳定性和复制可持续性，可以解决目前市售基体腹泻性贝类毒素标准品组分不明确且染毒贝类原料获取复制难、或者仅为单一毒素组分、或者为纯品毒素而缺乏基质基体的问题，具有积极的现实意义。具有积极的现实意义。具有积极的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法和分析方法


[0001]本专利技术涉及大田软海绵酸(OA)和鳍藻毒素
‑
1(DTX1)多组分标准样品
，尤其是一种扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法和分析方法。

技术介绍

[0002]含有毒素的微型藻类被贝类、甲壳类等摄食并生物富集，这些微藻毒素在贝类中累积形成了贝类毒素。贝类累积贝类毒素的过程非常复杂，不仅可以滤食并累积有毒藻类胞内毒素，还可以直接累积胞外毒素。贝类毒素是海洋天然有机物，处于食物链中的累积了贝类毒素的贝类产品，经过食用后进入人体，会产生肝肾毒性或神经毒性。贝类产品食用安全存在着潜在的巨大危害，是备受关注的重大公共卫生问题，也是制约我国海洋渔业经济发展的一个重要因素。
[0003]利玛原甲藻(Procentrum lima)是一种能同时产生大田软海绵酸(OA)和鳍藻毒素
‑
1(DTX1)的微型的底栖附生甲藻。OA和DTX1毒素是两种最为常见的可引起腹泻性中毒症状的贝类毒素，是腹泻性贝类毒素最典型的代表，是贝类食品安全检测的重要对象。
[0004]标准样品对食品安全质量检测技术体系起到核心作用,用以确保检测方法及数据可靠性、可比性、可追溯性。在国际上，建立毒素残留量分析方法需要经过3种类型的样品测试：受控组织或液体、用药物强化至或接近最大容许水平(MRL)的样品和本身具有毒素残留的基体样品，从而保证分析方法能具有一定的样品基质适用范围和重复性。基体标准样品可以对检测的全过程加以控制，在残留检测中越来越发挥不可或缺的作用。食品基体标准样品的研制已成为近年来的研究热点。
[0005]目前，国内外现有贝类毒素标准品主要有两种类型。一种是仅适用于小鼠生物法检测用的牡蛎基体腹泻性贝类毒素标准样品，该标准样品中只有腹泻性贝类毒素总量，而不确定具体的毒素组分的种类及各组分的含量，不能满足采用HPLC/MS/MS等理化分析方法检测各毒素组分含量的需要；此外，天然染毒贝类属于极其偶然性的资源，极易受到获取染毒贝类基料限制的原料不足问题影响，无法及时持续复制该标准样品，导致供应缺乏或供应终止。第二种是贝类毒素多组分或单一组分的纯品标准样品，均是从有毒藻类中提纯后的纯品，缺乏贝类基体，然而采用纯品的贝类毒素标准品进行分析，这种分析方法无法代表有毒微藻累积在贝类体内的藻类与贝类共融存在的状态，不能真实地重现有毒微藻毒素在贝类组织内共存时的贝类毒素提取效率，无法反映贝类产品基质样品中贝类毒素检测方法的准确性，从而影响检测结果的可靠性和有效性；此外，纯品贝类毒素标准品被列为有毒化学物质，多为国外进口，且价格相当昂贵，每个组分高达约6000元/100μg；世界各国对其出入境均有严格的管理限制，导致进口贝类毒素标准样品购买难且供货周期长。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了克服现有的OA和DTX1毒素的检测中存在的标准样品缺乏问
题，提供一种扇贝和利玛原甲藻基体OA和DTX1多组分标准样品制备方法，既解决了获取染毒贝类原料供应受限制而难于复制标准样品的问题，具有可持续性复制基体标准样品的优势，又解决了纯品贝类毒素标准品无法反映有毒微藻毒素在贝类组织内共存状态的贝类基质样品中贝类毒素检测提取效率问题，可用于定量或定性检测贝类产品中常见的OA和DTX1毒素的检测方法验证、能力验证评价等工作，为实验室检测质量控制提供技术保障。
[0007]现有腹泻性贝类毒素标准样品制备方法主要有两种方式：一种是直接采用经检测含有腹泻性贝类毒素的天然染毒贝类组织，直接粉碎冷冻干燥制备基体腹泻性贝类毒素标准样品，且该标准样品采用小鼠法定量腹泻性贝类毒素总含量值，仅适用于小鼠生物法检测用，不能满足采用HPLC/MS/MS等理化分析方法检测各毒素组分含量的需要；此外，因天然染毒贝类属于极其偶然性的资源，天然染毒贝类组织含有的贝类毒素组分及含量也存在极其的不固定性，复制标准样品时会出现毒素组分和毒素含量无法重现的问题，且复制时更极易受到获取染毒贝类基料限制的原料不足问题影响，无法持续复制标准样品，导致标准样品供应缺乏或供应终止，因而无法及时满足贝类产品安全质量检测控制的需要。第二种是以有毒微藻为原料，采用色谱分离、浓缩、结晶、干燥等精制方法制备获得纯品腹泻性贝类毒素标准品，此方法制备的标准品纯度较高，但无法代表有毒微藻累积在贝类体内的藻类与贝类组织内容物交融生长的共存状态，不能真实地重现在贝类机体内自然累积有毒微藻时的贝类毒素提取效率，从而影响贝类产品基体样品检测结果的可靠性和有效性。
[0008]利玛原甲藻在不同生长时期，藻细胞自身及所处环境等条件发生变化，导致其胞内外毒素的分配比例发生明显变化。然而贝类累积脂溶性贝毒的过程非常复杂，不仅可以滤食并累积胞内毒素，还可以直接累积胞外毒素。因此，采用利玛原甲藻与贝类组织基料混合成功制备OA和DTX1毒素多组分的基体标准样品难度高，存在着有毒利玛原甲藻胞内外毒素的分配比例、毒素藻泥与贝类组织含量配比、毒素藻泥与贝类组织基料混合均匀性差等多方面的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术采用利玛原甲藻与扇贝组织基料混合直接制备一种基于扇贝和利玛原甲藻基体OA和DTX1多组分标准样品，本专利技术所述的基体OA和DTX1多组分标准样品的制备方法选取同时含有OA和DTX1胞内外毒素的利玛原甲藻，并选择扇贝组织作为混合基料制备标准样品。因此本专利技术的标准样品基料来自于扇贝组织及同时含有OA和DTX1胞内外毒素的利玛原甲藻，无任何添加物，更好的保留贝类累积OA和DTX1胞内外毒素的利玛原甲藻基料中的原有成分，避免了不能真实地重现贝类毒素经过贝类滤食并累积有毒藻类胞内外毒素融合在动物体内的提取效率，提高了贝类产品中OA和DTX1毒素检测的准确性。
[0011]本专利技术更优于的是，由于利玛原甲藻含有的OA和DTX1毒素含量高，扇贝组织基本无毒素，优选地，本专利技术的混合基体的OA和DTX1标准样品包括利玛原甲藻和扇贝组织的混合制备成的基体冻干粉，进一步优选的，所述混合基体以适宜利玛原甲藻OA和DTX1胞内外毒素含量占比扇贝组织冻干粉质量的形式进行取料配制，具体配比以接种培养具有最佳生长速率初始藻密度的利玛原甲藻，在藻细胞生长至平台期(70天)时，胞内外毒素含量达最高水平，取料配制基体冻干粉中OA和DTX1毒素标准样品并预估配比含量。
[0012]第二方面，本专利技术提供了一种以扇贝组织、含胞内毒素的利玛原甲藻泥、含胞外毒素的利玛原甲藻细胞培养液为混合基料的OA和DTX1多组分标准样品制备过程中的基体均
匀处理方法。针对利玛原甲藻泥胶质体含量高、胞内毒素含量不均匀，难以与扇贝组织匀浆混匀的难题，本专利技术采用15％的蔗糖
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利玛原甲藻细胞培养液加热溶解胶质体、搅拌混匀利玛原甲藻泥的方法，通过冷冻干燥制备成毒素含量均匀的利玛原甲藻干粉，再与经均质、冷冻干燥制备成的扇贝组织干粉进行干粉基体再混匀，成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法，其特征在于：包括：(1)利玛原甲藻培养生长，获得含有OA和DTX1的利玛原甲藻泥胶质体；(2)将步骤(1)得到的所述利玛原甲藻泥胶质体，与含蔗糖的藻细胞培养液混合，加热，得到利玛原甲藻OA和DTX1胞内外毒素预混液；(3)获得扇贝组织匀浆基料，和步骤(2)得到的利玛原甲藻OA和DTX1胞内外毒素预混液混合，得到混合匀浆基料；(4)将步骤(3)获得的所述混合匀浆基料制成进行预冷冻，温度为
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60～
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80℃；(5)进行真空冷冻干燥，冷冻温度为
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10～
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50℃，干燥温度为
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10℃～30℃，得到冻干粗粉；(6)将所述冻干粗粉进行研磨、过筛，得到冻干细粉；(7)将所述冻干细粉采用干粉混匀器进行搅拌和均质，得到扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品。2.根据权利要求1所述扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述利玛原甲藻培养的初始密度为1500
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2500cells/mL，优选为2000cells/mL；培养周期为50
‑
75天，优选为60
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70天；任选的，含有OA和DTX1的利玛原甲藻泥胶质体中OA的胞内浓度为16
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17pg/cell，胞外浓度为12
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14pg/cell；DTX1的胞内浓度为11
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13pg/cell，胞外浓度为6
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8pg/cell。3.根据权利要求1所述扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述含蔗糖的藻细胞培养液中，蔗糖的质量比例为10
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20％，优选为15％；任选的，所述利玛原甲藻泥胶质体，与含蔗糖的藻细胞培养液混合的质量比为1:2，混合后加热的温度为25
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35℃，时间为15～20min，得到均一的利玛原甲藻OA和DTX1胞内外毒素预混液。4.根据权利要求1所述扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述扇贝组织匀浆基是将扇贝组织采用均质粉碎机以10000
‑
20000r/min进行均质得到；任选的，所述扇贝组织匀浆基料和所述利玛原甲藻OA和DTX1胞内外毒素预混液混合后，搅拌混合至少10min，再使用均质粉碎机以10000
‑
20000r/min进行均质，至少均质3次，每次均质5
‑
10min，得到所述混合匀浆基料；任选的，所述扇贝组织匀浆基料，和所述利玛原甲藻OA和DTX1胞内外毒素预混液混合时，根据所述利玛原甲藻OA和DTX1胞内外毒素预混液中OA和DTX1的浓度，以DSP毒素含量为未检出为标准，即所述混合匀浆基料中的DSP毒素含量小于10.0ug/kg。5.根据权利要求1所述扇贝和利玛原甲藻混合基体OA和DTX1标准样品的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述预冷冻是将所述混合匀浆基料在常压下于
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70～
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80℃预冷冻2～3h；任选的，步骤(5)中，所述真空冷冻干燥包括第一次冷冻干燥和第二次冷冻干燥，物料的厚度为1～2cm，所述第一次冷冻干燥依次包括
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50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻8h，
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10℃～30℃快速升温干燥8h；所述第二次冷冻干燥依次包括：

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晶，曹际娟，徐敦明，王伟，李雨哲，
申请(专利权)人：大连民族大学厦门海关技术中心，
类型：发明
国别省市：