一种在微流场中利用烯还原酶生成（S）-2-甲基环己酮的方法技术

本发明专利技术公开了一种在微流场中利用烯还原酶生成（S）

【技术实现步骤摘要】
一种在微流场中利用烯还原酶生成(S)
‑2‑
甲基环己酮的方法


[0001]本专利技术属于化学合成
，特别涉及一种在微流场中利用烯还原酶生成(S)
‑2‑
甲基环己酮的方法。

技术介绍

[0002](S)
‑2‑
甲基环己酮是非常重要的药物前体，可以用来合成许多高附加值药物中间体，在医药合成领域的具有一定的应用潜力。然而，目前合成(S)
‑2‑
甲基环己酮的方法中多有金属氢化物介导、Pd配体参与、极端温度和/或极端pH等苛刻条件。由于金属催化剂的毒性，并且这些苛刻条件给(S)
‑2‑
甲基环己酮的合成带来挑战，越来越多的科学家致力于研究高效绿色合成(S)
‑2‑
甲基环己酮方法。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：针对现有技术的不足，本专利技术提供一种在微流场中结合烯还原酶及其突变株对消旋的2
‑
甲基环己酮去消旋化合成(S)
‑2‑
甲基环己酮的方法(图1)。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术设计的反应装置如图2所示。以消旋的2
‑
甲基环己酮为原料，固定化的烯还原酶作为生物催化剂进行催化，主要分为两个反应步骤：首先利用野生型烯还原酶催化的非天然反应
‑
脱氢拆分反应，将(R)
‑2‑
甲基环己酮脱氢生成2
‑
甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
酮；在提供辅酶循环的条件下，再利用工程化烯还原酶催化2
‑
甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
酮还原得到(S)
‑2‑
甲基环己酮。
[0005]具体地，所述反应包括如下步骤：
[0006]S1：以2
‑
甲基环己酮为原料，将固定在树脂上的野生型烯还原酶固定在第一微通道中，利用野生型烯还原酶催化的脱氢拆分反应，在第一微通道中将(R)
‑2‑
甲基环己酮催化成2
‑
甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
酮；
[0007]S2：将工程化的烯还原酶和葡萄糖脱氢酶(GDH)吸附在树脂上作为生物催化剂固定到第二微通道中，注射S1反应液到第二微通道，并连续添加NADP
+
和葡萄糖，将2
‑
甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
酮还原得到(S)
‑2‑
甲基环己酮。
[0008]步骤S1中，所述烯还原酶TsER的制备方法如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烯还原酶TsER的基因构建到pET
‑
28a(+)载体上，并转入到大肠杆菌BL 21(DE3)中，培养并纯化得到对应的烯还原酶TsER。
[0009]其中，SEQ ID NO.1是通过对序列号为Q5SLY6的序列改良而来，Q5SLY6序列总长1050，可以在NCBI上搜索得到。SEQ ID NO.1序列总长1059，其中，前端三个碱基属于限制性内切酶位点，后端六个也是限制性内切酶位点。
[0010]步骤S1中，反应的溶剂为磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，50mM，pH 7.4)与有机溶剂的混合物，所述有机溶剂包括但不限于正庚烷、异辛烷、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二甲基亚砜；其中，有机溶剂的体积小于等于反应总体积的百分之一。
[0011]步骤S1中，所述野生型烯还原酶为来源于Thermus scotoductus SA
‑
01的TsER。
[0012]步骤S2中，所述工程化烯还原酶为来源于Thermus scotoductus SA
‑
01的TsER的突变株TsER C25G/I66T，突变的思路可参照期刊ChemBioChem.2017,18(7),685
‑
691。
[0013]步骤S2中，所述GDH为来源于芽孢杆菌的商业化酶。
[0014]步骤S1和S2中，所述吸附纯酶的树脂包括但不限于水性吸附树脂ES
‑
1、ES
‑
103B、ES
‑
108。
[0015]步骤S1和S2中，所述树脂投入使用前需先活化，再吸附纯酶。烯还原酶在树脂上固定的方法为：将培养并纯化得到的烯还原酶分散于浸有树脂的磷酸盐缓冲液中，于20～22℃下缓慢搅拌后取出树脂，将树脂于
‑
80℃冷磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液，50mM，pH 7.4，优选地，搅拌24h后取出树脂。
[0016]步骤S1和S2中，所述烯还原酶纯化后分散于PBS缓冲液中，经由树脂吸附固定在微通道中参与反应，可利用紫外分光光度计测得纯酶在树脂上的吸附率。吸附率的计算公式为(空白吸光度值
‑
上清液吸光度值)/空白吸光度值。
[0017]步骤S1和S2中，反应的温度为25～35℃，优选25℃；微通道的内径为1～3mm，优选1mm。
[0018]综上，本专利技术提供了利用微通道反应装置通过固定化酶催化得到(S)
‑2‑
甲基环己酮的方法，以2
‑
甲基环己酮为原料，利用烯还原酶的非天然反应
‑
脱氢反应和天然反应
‑
还原反应，将纯酶固定在在微流场反应技术装置中，利用两步酶组合催化得到去消旋化的(S)
‑2‑
甲基环己酮。本专利技术具有光学纯度高、选择性好、反应条件温和、可持续性强、产物收率高、安全性高、反应快速等优点。
[0019]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：
[0020](1)本专利技术首次在微流场中，通过固定化烯还原酶及其对应的突变株，利用同一种酶的非天然反应
‑
脱氢拆分反应与天然反应
‑
还原反应，两步酶组合催化，将2
‑
甲基环己酮去消旋化，得到利用化学方法难以合成的(S)
‑2‑
甲基环己酮。该方法避免了金属催化、高温、污染严重的制备方法，操作简单，光学纯度高、选择性好、反应条件温和、可持续性强、产物收率高、安全性高、反应快速，更符合绿色化学的要求；
[0021](2)本专利技术采用固定化纯酶的方法，将纯酶吸附在水性树脂中，有单酶的固定，也有烯还原酶与葡萄糖脱氢酶的共固定，最终填充固定于微通道反应器中，可以保存在低温下，便于重复使用；
[0022](3)本专利技术利用微通道反应技术，实现传质传热速度和反应速率的1～3个数量级的提升；实时在线反应量较小，过程易于控制；其连续流、低返混特征可有效提升反应的选择性。
附图说明
[0023]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做更进一步的具体说明，本专利技术的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0024]图1为本专利技术的反应路线图。
[0025]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在微流场中利用烯还原酶生成（S）
‑2‑
甲基环己酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：以2
‑
甲基环己酮为原料，将固定在树脂上的野生型烯还原酶固定在第一微通道中，利用野生型烯还原酶催化的脱氢拆分反应，在第一微通道中将（R）
‑2‑
甲基环己酮催化成2
‑
甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
酮；S2：将工程化的烯还原酶和葡萄糖脱氢酶吸附在树脂上作为生物催化剂固定到第二微通道中，注射步骤S1得到的反应液到第二微通道，并连续添加NADP
+
和葡萄糖，将2
‑
甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
酮还原得到（S）
‑2‑
甲基环己酮。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述野生型烯还原酶为来源于Thermus scotoductus SA
‑
01的TsER。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述工程化烯还原酶为来源于Thermus scotoductus SA
‑
01的TsER的突变株TsER C25G/I66T。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，TsER的制备方法如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烯还原酶TsER的基因构建到pET
‑
28a（...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭凯，王雨清，胡玉静，陈杰，赵明业，王合永，黄桂翔，潘婕，咸漠，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：