一种对映选择性翻转的ω-转氨酶突变体的构建及应用制造技术

本发明专利技术第一方面提供了一种对映选择性翻转的ω

【技术实现步骤摘要】
一种对映选择性翻转的
ω
‑
转氨酶突变体的构建及应用


[0001]本专利技术涉及酶工程领域，具体涉及一种对映选择性翻转的ω
‑
转氨酶突变体的构建及应用。

技术介绍

[0002]转氨酶分为两类，α
‑
转氨酶和ω
‑
转氨酶。α
‑
转氨酶包括I，III和IV型亚族，催化转氨反应时依赖底物酮的α
‑
羧酸。而ω
‑
转氨酶属于II型亚族，不依赖底物酮的α
‑
羧酸，被广泛应用于多种脂肪酮和芳香酮的不对称转氨反应，生成立体专一性的胺。其中ATA117是广泛应用的ω
‑
转氨酶之一。2008年Wolfgang Kroutil课题组报道ATA117可高效催化一系列芳香酮如4
‑
苯基
‑2‑
丁酮和脂肪酮如辛酮产生R构型的胺，ee≥99％。Wolfgang Kroutil课题组在2010年报道ATA117可催化有机硒乙酰苯生成立体专一性的R
‑
对硒苯乙胺，后者是钯催化剂的手性配基。同年，Gregory J.Hughes课题组通过对ATA117进行多轮酶进化获得了ATA
‑
117
‑
Rd11突变体，该突变体实现了对大位阻底物西他列汀前体酮的有效催化。而2020年Yu
‑
Guo Zheng课题组利用ATA
‑
117
‑
Rd11突变体催化产生立体专一性的L
‑
草丁膦产物，ee＞99％，80kg的反应前体24小时被转化成70kg的L
‑
草丁膦产物。综上表明，ω
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转氨酶ATA117的底物谱较广，可高效催化多种底物产生立体专一性的胺。
[0003]ω
‑
转氨酶除了能产生立体专一性的胺，同时对邻位的手性中心也具有一定的对映选择性。2009年Wolfgang Kroutil课题组报道通过ω
‑
转氨酶ATA117对外消旋醛底物的动力学拆分获得了R
‑4‑
苯基
‑2‑
吡咯烷酮。ATA117对醛邻位的手性中心存在对映选择性，通过助溶剂和pH的优化，其转氨产物的ee可达68％。2013年Vicente Gotor课题组考察了24种商业S
‑
和R
‑
转氨酶对外消旋的α
‑
烷基
‑
β
‑
酮酯的动力学拆分情况，结果表明其催化效率较高，但非对映选择性较差。2014年Wolfgang Kroutil课题组考察了假单胞菌属，节杆菌属，土曲霉属和生丝单胞菌属来源的ω
‑
转氨酶对外消旋的2
‑
苯基丙醛及对位间位邻位甲基和甲氧基取代的2
‑
苯基丙醛的动力学拆分情况，表征了这些转氨酶对邻位手性中心的立体选择性，其ee(R)＝76
‑
98％。Wolfgang Kroutil课题组在2018年考察了节杆菌属KNK168,土曲霉，禾谷镰孢菌，生丝单胞菌，费氏新萨托菌，巨大芽孢杆菌等来源的ω
‑
转氨酶对外消旋脂肪醛的动力学拆分情况，通过一步转氨反应，获得了高立体选择性的抗癫痫药物布瓦西坦和普瑞巴林。其中，生丝单胞菌来源的ω
‑
转氨酶通过一步动力学拆分可获得高立体选择性的R
‑
布瓦西坦手性中间体，ee可达92％。Wolfgang Kroutil课题组分别在禾谷镰孢菌来源的ω
‑
转氨酶和ArRmut11突变体的基础上做了几个氨基酸位点的突变，所获得的突变体催化外消旋脂肪醛合成了S
‑
普瑞巴林，其ee分别可达76％和80％。2019年Iv
á
n Lavandera课题组报道了一系列商业转氨酶和巨大芽孢杆菌来源的转氨酶及其突变体对外消旋的α
‑
烷基
‑
β
‑
酮酰胺底物的动力学拆分情况，其中商业R转氨酶对该类底物的催化效率和立体选择性最高，其非对映选择性de可达96％。而巨大芽孢杆菌来源的转氨酶及其突变体仅可转化部分底物，其非对映选择性较低。综上，文献报道中大多通过筛选不同种属来源的ω
‑
转氨酶，可获得对醛底物邻位手性中心的高立体选择性，而通过筛选商业转氨酶可获得对酮底
物如α
‑
烷基
‑
β
‑
酮酰胺的邻位手性中心的高立体选择性。但目前未有文献报道ω
‑
转氨酶对手性芳香羟酮化合物的对映选择性。
[0004]因此对于本领域技术人员而言，如何提供一种对手性芳香羟酮化合物高对映选择性的ω
‑
转氨酶，使其应用于动力学拆分合成(1R,2R)
‑
氨基二醇产物，是一个急需要解决的问题。

技术实现思路

[0005]目前如何提供一种对手性芳香羟酮化合物高对映选择性的ω
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转氨酶，使其应用于动力学拆分合成(1R,2R)
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氨基二醇产物，对于本领域技术人员而言，是一个急需要解决的问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术基于半理性设计对ω
‑
转氨酶ATA117进行分子改造，结合基因的迭代饱和突变方法，获得了相应的突变体。
[0007]本专利技术第一方面提供了一种对映选择性翻转的ω
‑
转氨酶ATA117突变体，该突变体的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]进一步地，该突变体是ATA117的氨基酸序列通过迭代的饱和突变而产生的的，具有第N1位的缬氨酸，第N2位的苯丙氨酸，第N3位的异亮氨酸，第N4位的苯丙氨酸中至少一者的突变。
[0009]进一步地，第N1位的缬氨酸突变为丙氨酸。
[0010]进一步地，第N2位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸。
[0011]进一步地，第N3位的异亮氨酸突变为组氨酸。
[0012]进一步地，第N4位的苯丙氨酸突变为组氨酸。
[0013]进一步地，该突变体对外消旋的对甲砜基苯基二羟酮1具有较高的R
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对映选择性。
[0014]本专利技术第二方面，提供了一种DNA，含有编码该ω
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转氨酶ATA117突变体的核苷酸序列。
[0015]进一步地，DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0016]本专利技术第三方面，提供了一种携带上述核苷酸序列的质粒。
[0017]进一步地，携带编码ω
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转氨酶ATA117基因的重组质粒是由泓迅生物科技股份有限公司合成ATA117基因后酶切连接插入pRSFduet
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1载体salⅠ/HindⅢ酶切位点中所得。
[0018]本专利技术第四本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对映选择性翻转的ω
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转氨酶ATA117突变体，其特征在于，所述ω
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转氨酶ATA117突变体的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.如权利要求1所述的ω
‑
转氨酶ATA117突变体，其特征在于，所述ω
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转氨酶ATA117突变体是ω
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转氨酶ATA117的氨基酸序列通过迭代的饱和突变而产生的的，所述ω
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转氨酶ATA117突变体具有第N1位的缬氨酸，第N2位的苯丙氨酸，第N3位的异亮氨酸，第N4位的苯丙氨酸中至少一者的突变。3.如权利要求2所述的ω
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转氨酶ATA117突变体，其特征在于，第N1位的缬氨酸突变为丙氨酸，第N2位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸，第N3位的异亮氨酸突变为组氨酸，第N4位的苯丙氨酸突变为组氨酸。4.一种DNA核苷酸序列，其特征在于，所述DNA核苷酸序列含有编码如权利要求2所述的ω
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转氨酶ATA117突变体的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的一种DNA核苷酸序列，其特征在于，所述DNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。6.一种携带如权利要求5所述的DNA核苷酸序列的质粒。7.一种表达ω
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转氨酶ATA117突变体的基因工程菌，其特征在于，所述ω...

【专利技术属性】
技术研发人员：林双君，刘琦，邓子新，黄婷婷，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：