一种重组人源融合胶原蛋白及其高效羟基化方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种重组人源融合胶原蛋白及其高效羟基化方法与应用。该重组人源融合胶原蛋白的基酸序列如SEQ ID No.1所示，其细胞活性比单一蛋白的高。通过将来源于炭疽芽孢杆菌的脯氨酸羟化与人源胶原基因构建双质粒共表达，先诱导表达来源于炭疽芽孢杆菌的脯氨酸羟化酶，待胞内羟化酶积一定量后，再诱导强启动子控制下的胶原蛋白快速表达，通过调控酶和胶原蛋白的表达时间点，实现大子量融合胶原的表达及同步高效羟基化，羟化率达到63％，羟化率更高的胶原蛋白其稳定性更好且生物性更高。率更高的胶原蛋白其稳定性更好且生物性更高。率更高的胶原蛋白其稳定性更好且生物性更高。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源融合胶原蛋白及其高效羟基化方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种重组人源融合胶原蛋白及其高效羟基化方法与应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是人体及其他哺乳动物中最丰富的蛋白质，约占人体总蛋白的30％，目前已知的胶原蛋白家族多达30种。胶原蛋白由其三螺旋结构和独特的Gly
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Xaa
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Yaa重复序列组成，其中Xaa通常是脯氨酸，而Yaa是羟脯氨酸(Hyp)。Yaa位置的羟脯氨酸稳定了胶原的三螺旋结构，在胶原结构中极其重要。I、II和III型胶原蛋白是胶原纤维的主要成分，其中Ⅰ型胶原蛋白广泛存在于真皮、骨骼、肌腱及韧带中，组装成高度有序的纤维组织，对皮肤起支撑作用；Ⅱ型胶原蛋白通常存在于肌腱和韧带附着点的纤维软骨区，在软骨中构成纤细的网状结构；Ⅲ型胶原除分布于胎盘外，还与Ⅰ型胶原蛋白共同存在于皮肤、肌腱、韧带、血管等结缔组织，构成细胞外基质网状结构，起到支撑器官、保护机体的作用，还与细胞附着、细胞迁移有关。
[0003]胶原蛋白已广泛用于药物传输系统、组织工程系统、保健食品、化妆品等领域。市售胶原蛋白以畜禽源动物组织及海洋生物提取为主。目前，生产胶原蛋白的原料有畜禽骨头、皮肤组织、海参、鱼鳞、鱼皮及鱼骨等。由于从动物中提取的胶原蛋白可能携带病毒、细菌、毒素等污染，存在免疫原性及动物源疾病传播的风险；同时提取方法各异，有酸、碱、盐法提取等多种，均存在提取率低(酸法仅12.3％，碱法仅11.8％)、氨基酸破环严重等缺点，而且提取后产生的酸性或碱性废液必须进行严格后处理，否则造成严重环境污染。综上，从动物中提取已不再适用于大规模生产制备质量均一的胶原蛋白，而微生物发酵生产重组胶原蛋白已渐成趋势，也取得了规模化生产及应用。用于发酵的微生物包括大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌等，但由于微生物体内缺乏脯氨酸羟化酶基因，不能形成含脯氨酸羟基化修饰的胶原蛋白；而动物的脯氨酸羟化酶由于其复杂的结构(多聚体)，在微生物体内表达后活性低，限制了其应用，因此迫切需要共表达结构简单、高活性的羟化酶以实现在微生物中获得羟基化修饰的胶原蛋白。
[0004]现有技术中，虽然对Ⅰ型、Ⅲ型人源胶原蛋白的重组表达进行了一些报道：例如CN11093383A公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法，选取了人源Ⅰ型胶原蛋白保守序列GSKGDTGEPGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEP重复9次，通过原核表达，制备水溶性好的重组人源胶原蛋白；CN111087463A则公开了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其原核表达方法，选取Ⅲ型胶原蛋白154～482氨基酸序列进行重组表达，获得具有良好生物活性的重组蛋白。这两个技术将I型或III型胶原蛋白的片段进行单独表达，其分子量较小，只有30～40kDa。由于I型和III型胶原蛋白具有不同的特点，本专利技术制备了一种I型和III型融合的人源胶原蛋白，功能更加完善，并且分子量为120kDa，更能满足生物材料制备的多样性需求。
[0005]CN111087464A公开了一种在大肠杆菌体内通过pACYCDute
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1质粒由IPTG诱导同时表达巨型病毒脯氨酸羟化酶Hy726制备羟基化的重组人源Ⅲ型胶原蛋白；CN109022464A公
开了将孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶与人源胶原蛋白构建到单个质粒Pkk223
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TPH
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COL3A1，在大肠杆菌体内加入IPTG时降温同时诱导胶原蛋白和羟化酶表达、及分别构建到质粒pPICZB
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TPH和质粒pPIC9k
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COL1A1整合到毕赤酵母GS115基因组进行甲醇诱导同时共表达得到羟基化重组胶原蛋白，上述两种方法中未对其羟脯氨酸含量进行报道，而胶原蛋白中羟脯氨酸含量与其结构稳定性和细胞受体结合密切相关。并且上述两个技术中的共表达策略是将羟化酶与胶原蛋白同时诱导表达，而本专利技术将使用不同强度启动子对羟化酶与胶原蛋白进行分别精确调控，在弱启动子(阿拉伯糖启动子)诱导羟化酶表达一定时间后再诱导强启动子(T7)迅速表达胶原蛋白(减少胶原蛋白的表达时长)，既能减少胶原蛋白长时间在大肠杆菌体内存在而被蛋白酶降解的风险，又能让胶原蛋白在表达后即能被脯氨酸羟化酶及时羟化，提升羟化效果。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种重组人源融合胶原蛋白。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供上述重组人源融合胶原蛋白的高效羟基化方法。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供通过上述重组人源融合胶原蛋白的高效羟基化方法的应用。
[0009]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0010]一种重组人源融合胶原蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。该重组人源融合胶原蛋白是将Ⅰ型胶原蛋白肽段和Ⅲ型胶原蛋白肽段进行串联2次得到，结构为I
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III
‑
I
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III。
[0011]SEQ ID No.1:
[0012]MGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGGGSGRPGERGLPGENGVMGFPKPGEPGPKGMPGERGRPGERGLPGENGVMGFPKPGEPGPKGMPGERGRPGERGLPGENGVMGFPKPGEPGPKGMPGERGRPGERGLPGENGVMGFPKPGEPGPKGMPGERGRPGERGLPGENGVMGFPKPGEPGPKGMPGERGRPGERGLPGENGVMGFPKPGEPGPKGMPGERGRPGERGLPGENGVMGFPKPGEPGPKGMPGERGRPGERGLPGENGVMGFPKPGEPGPKGMPGERGSEAAAKGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGFPGERGERGDLGPQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人源融合胶原蛋白，其特征在于：氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。2.权利要求1所述的重组人源融合胶原蛋白的编码核酸。3.根据权利要求2所述的重组人源融合胶原蛋白的编码核酸，其特征在于：所述的编码核酸的序列如SEQ ID No.2所示。4.一种重组表达载体，其特征在于：含有权利要求2或3所述的重组人源融合胶原蛋白的编码核酸。5.一种重组基因工程菌，其特征在于：含有权利要求4所述的重组表达载体。6.权利要求1所述的重组人源融合胶原蛋白的高效羟基化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将权利要求2或3所述的重组人源融合胶原蛋白的编码核酸克隆到表达载体上，得到胶原蛋白重组表达载体；(2)将脯氨酸羟化酶的编码核苷酸克隆到表达载体上，得到羟化酶重组表达载体；(3)将胶原蛋白重组表达载体和羟化酶重组表达载体共转化大肠杆菌宿主细胞，得到重组基因工程菌，然后进行诱导表达；(4)将步骤(3)诱导表达的菌液进行固液分离，取菌体破碎；(5)将破碎的菌体进行固液分离，取上清；将上清纯化，得到羟基化的重组人源融合胶原蛋白；所述的脯氨酸羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。7.根据权利要求6所述的重组人源融合胶原蛋白的高效羟基化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的表达载体为大肠杆菌表达载体；步骤(2)中所述的脯氨酸羟化酶的编码核苷酸的序列如SEQ ID NO.4所示；步骤(2)中所述的表达载体为大肠杆菌表达载体，其含有的启动子弱于步骤(1)中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，刘苏，马毅，傅宏鑫，王蒙，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：