一种通过顺序整合ALP、TYR、HRP构建三酶级联荧光免疫传感平台的方法技术

本发明专利技术通过顺序整合ALP、TYR和HRP构建了一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法。此平台依赖于HRP和H2O2可以促进多巴胺和1，5

【技术实现步骤摘要】
一种通过顺序整合ALP、TYR、HRP构建三酶级联荧光免疫传感平台的方法


[0001]本专利技术涉及一种通过顺序整合碱性磷酸酶、酪氨酸酶和辣根过氧化物酶用来构建三酶级联触发的荧光免疫传感器平台的方法和应用，用于灵敏和选择性地检测心肌钙蛋白，属于生物传感


技术介绍

[0002]酶级联反应可以依次进行多个酶促反应，是生物系统中信号转导和放大的重要组成部分，在生物技术中也具有广泛的应用前景。在这种反应过程中，第一种酶催化得到的产物能够直接用作第二种酶的反应底物，并且原位获得的催化产物局部浓度较高，能够降低酶中间体的无效扩散。因此，与单酶催化放大相比，酶级联放大体系展现了更高的催化效率。
[0003]目前，人们越来越关注开发具有集成多个生物催化转化的新信号生成的多级酶联传感系统。迄今为止，已开发出多种多酶级联诱导反应的方法，如比色法、电化学法、化学发光法、荧光法等。然而，大多数酶级联传感系统都是基于特定的比色法，其中碱性磷酸酶ALP和HRP是常用的诱导酶。此外，因为缺乏适合系统的新型底物，导致酶级联传感系统中的底物/产物的信号输出模式过少。例如，Yang小组开发了一种酶级联免疫测定法，通过偶联ALP和TYR，基于酶诱导的荧光和比色反应检测cTnI。Chang组报道了一种基于铜纳米粒子自组装增强荧光信号的双酶级联生物传感器，用于超灵敏检测MicroRNA153。然而，据我们所知，已报道的酶级联传感系统大多数采取双酶策略并且是在非生物环境下。但在生物系统中，酶级联反应往往需要两种以上的酶。此外，酶的底物不仅是分子内的相互作用，还包括许多物质的相互作用。因此，开发具有新信号产生机制的多级酶联传感系统是非常有必要的。
[0004]为了克服这些不足，这里我们将采用温和的合成条件、简便的合成步骤构建了一个ALP
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TYR
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HRP三酶级联触发的荧光免疫传感平台，该检测方法兼具快速响应、高选择性和灵敏度高的优点。

技术实现思路

[0005]本专利技术解决的技术问题是：为了克服现有技术的不足，提出一种基于ALP
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TYR
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HRP的三酶级联荧光免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测心肌钙蛋白的方法。HRP和H2O2可以促进多巴胺和1，5
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萘二酚的快速原位荧光反应产生强烈的黄色荧光化合物(AFC)。首先，ALP可以诱导PAPP的水解产生中间体酪胺。进一步引入TYR可以催化DA的产生，进而激活HRP，从而实现ALP、TYR和HRP三种酶参与的信号放大。此外，涉及ALP的级联催化过程被整合到ELISA中(ALP用作标记酶，TYR和HRP用作信号报告酶)。
[0006]为了解决本专利技术的技术问题，提出的技术方案为：碱性磷酸酶ALP以诱导对氨基乙基苯基磷酸盐PAPP的水解产生中间体酪胺，进一步引入TYR可以催化DA的产生，进而激活HRP，HRP和H2O2可以促进多巴胺和1，5
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萘二酚的快速原位荧光反应产生强烈的黄色荧光化
合物AFC C
18
H
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NO4；从而实现ALP、TYR和HRP三种酶参与的信号放大，黄色荧光化合物AFC的激发波长和发射波长分别固定在490nm和550nm，并通过核磁质谱对AFC进行表征，确定了AFC的分子式和结构；AFC结构式如下：
[0007]HRP和H2O2可以促进多巴胺和1，5
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萘二酚的快速原位荧光反应产生强烈的黄色荧光化合物(AFC)。ALP可以诱导对氨基乙基苯基磷酸盐(PAPP)的水解产生中间体酪胺。进一步引入TYR可以催化DA的产生，进而激活HRP，从而实现ALP、TYR和HRP三种酶参与的信号放大。此外，涉及ALP的级联催化过程被整合到ELISA中(ALP用作标记酶，TYR和HRP用作信号报告酶)。然后将混合物在室温下振荡3分钟，在490nm激发下通过荧光光谱仪对其进行荧光强度检测。
[0008]预期的ALP催化PAPP中磷酸基团的裂解，诱导PAPP转化为酪胺，酪胺被TYR氧化为DA，HRP和H2O2的共同作用促进DA和DHA的快速原位荧光反应生成荧光化合物AFC，我们采用了紫外
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可见吸收光谱和荧光光谱研究了AFC的光学性质，DA
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DHA
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HRP
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H2O2混合溶液在550nm处有一个较强的发射峰，而DA
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DHA、DA
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DHA
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HRP、DA
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DHA
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H2O2混合物没有荧光。
[0009]进一步的，为了得到AFC生成的最佳条件，我们优化了反应体系的pH值、反应时间和反应物浓度。首先，考虑到实际的分析应用，我们选择Tris
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HCl缓冲液的pH值为7.4。反应体系的荧光强度在3min时可以达到稳定。因此，DA与DHA的最佳反应时间为3min。然后，对反应物浓度的影响进行优化，随着DA、DHA和H2O2浓度的增大，F1/F0的值迅速增大，当DA、DHA和H2O2分别为400μM、30μM、60μM时，F1/F0趋于稳定。因此，DA、DHA和H2O2浓度的有利试验条件分别为400μM、30μM、60μM。
[0010]进一步的，在紫外光照射下，AFC在490nm处有一个吸收峰，且可以观察到明亮的黄色荧光。AFC的激发波长和发射波长分别固定在490nm和550nm，显示出约60nm的斯托克斯位移。通过理论计算，AFC在550nm附近的发射峰的产生，可以归因于自然跃迁轨道(NTO)所展示的最低单重态激发态(S1)的部分电荷转移特性。接着，AFC的化学结构通过1H NMR、
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C NMR和高分辨质谱进行了表征和确认。
[0011]进一步的，首先，DA在氧气的存在下被氧化为邻醌结构，邻醌结构与DHA之间进一步发生分子间1，4
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Michael加成，生成中间体B。B的再芳构化形成偶联产物C，但C容易被氧化成醌D，随后通过分子内Michael加成得到呋喃中间体E，E的烯醇结构在一定条件下可以重排成酮的形式。最后，氨基和羰基发生分子内缩合反应，生成AFC。值得注意的是，大气氧的氧化剂是催化邻苯二酚氧化形成强发射荧光团AFC的先决条件。
[0012]进一步的，所述的在HRP和H2O2共同作用下，DA和DHA发生原位环化反应，产生显著的荧光信号。本专利技术通过顺序整合ALP、TYR和HRP构建了一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台。Yang小组开发了一种酶级联免疫测定法，在碱性条件下，多巴胺和间苯二酚发生原位环化反应，通过偶联ALP和TYR，基于酶诱导的荧光和比色反应检测cTnI。相对于本专利技术，该报道中反应条件不够温和，其次，构建的是一个两酶级联触发的荧光免疫传感平台，催化放
大效果相对本专利技术不具备优势，最后，多巴胺和间苯二酚的反应产物发射峰在460nm，蓝色发射。本专利技术中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过顺序整合ALP
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TYR
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HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：首先，碱性磷酸酶ALP以诱导对氨基乙基苯基磷酸盐PAPP的水解产生中间体酪胺，进一步引入TYR可以催化DA的产生，进而激活HRP，HRP和H2O2可以促进多巴胺和1，5
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萘二酚的快速原位荧光反应产生强烈的黄色荧光化合物AFC C
18
H
15
NO4；从而实现ALP、TYR和HRP三种酶参与的信号放大，黄色荧光化合物AFC的激发波长和发射波长分别固定在490nm和550nm，并通过核磁质谱对AFC进行表征，确定了AFC的分子式和结构；AFC结构式如下：2.根据权利要求1通过顺序整合ALP
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TYR
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HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：预期的ALP催化PAPP中磷酸基团的裂解，诱导PAPP转化为酪胺，酪胺被TYR氧化为DA，HRP和H2O2的共同作用促进DA和DHA的快速原位荧光反应生成荧光化合物AFC，我们采用了紫外
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可见吸收光谱和荧光光谱研究了AFC的光学性质，DA
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DHA
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HRP
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H2O2混合溶液在550nm处有一个较强的发射峰，而DA
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DHA、DA
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DHA
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HRP、DA
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DHA
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H2O2混合物没有荧光。3.根据权利要求1通过顺序整合ALP
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TYR
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HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：为了得到AFC生成的最佳条件，我们优化了反应体系的pH值、反应时间和反应物浓度，首先，考虑到实际的分析应用，我们选择Tris
‑
HCl缓冲液的pH值为7.4，反应体系的荧光强度在3min时可以达到稳定，DA与DHA的最佳反应时间为3min，然后，对反应物浓度的影响进行优化，随着DA、DHA和H2O2浓度的增大，F1/F0的值迅速增大，当DA、DHA和H2O2分别为400μM、30μM、60μM时，F1/F0趋于稳定，因此，DA、DHA和H2O2浓度的有利试验条件分别为400μM、30μM、60μM。4.根据权利要求1通过顺序整合ALP
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TYR
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HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：通过吸收光谱和荧光光谱研究了AFC的光学性质，在紫外光照射下，AFC在490nm处有一个吸收峰，且可以观察到明亮的黄色荧光，AF...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，孙玉洁，马雯霖，马怡菲，刘晓雪，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：