RBBP7基因/蛋白作为药物靶点在制备诊断及治疗男性不育疾病产品中的应用制造技术

本发明专利技术提供了RBBP7基因/蛋白作为药物靶点在制备诊断及治疗男性不育疾病产品中的应用。实验表明RBBP7突变基因/蛋白导致男性不育、精子发生障碍、生精阻滞、无精子。本发明专利技术的RBBP7突变基因/蛋白及其1个致病突变位点可作为诊断男性不育的靶基因。同时，RBBP7基因/蛋白的RBBP7的表达水平非梗阻性无精子患者中显著降低，通过提高RBBP7蛋白活性和/或表达量可以预防和/或治疗男性不育症。以预防和/或治疗男性不育症。

【技术实现步骤摘要】
RBBP7基因/蛋白作为药物靶点在制备诊断及治疗男性不育疾病产品中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及RBBP7基因和/或蛋白作为分子标志物在诊断男性不育疾病中的应用，以及涉及对人类男性不育症基因致病突变位点的检测方法。

技术介绍

[0002]近几十年来，全世界男性生殖能力不断下降，精子的数量及质量都在降低。育龄夫妇不孕不育患病率高达15％，其中男性因素约占50％，男性不育症给个人、家庭和社会带来了沉重的负担。临床上男性不育主要表现为少弱畸精子症或无精子症，其中非梗阻性无精子症 (non
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obstructive azoospermia,NOA)，其病变部位主要在于睾丸，导致精液中检测不到精子，是男性不育中最严重的情况之一。导致男性不育症的病因复杂，包括生殖系统解剖结构及功能因素、感染因素、内分泌免疫因素、遗传因素、精神心理因素等等。基因缺陷引起的睾丸生精功能障碍约占男性不育症的10％
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15％，部分少弱精子症及无精子症患者能够通过辅助生殖技术(ART)获得自己的后代，但对于基因缺陷导致的男性不育或精子发生异常，ART可使其发生垂直传递，从而影响子代的生殖健康。
[0003]RBBP7基因位于X染色体上，属于高度保守的WD
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repeat蛋白亚家族，其是许多组蛋白修饰和染色质重塑复合体的重要组成成分，参与细胞内组蛋白乙酰化、去乙酰化、DNA甲基化等生物学进程，调控许多生理、病理过程。在临床上，仅知视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤 1(Wilms 1)等一些癌症与RBBP7表达水平异常相关，但目前没有发现该基因突变导致疾病发生的家系或其他直接证据。RBBP7功能多样，在肾母细胞瘤中，RBBP7是肿瘤抑制因子 WT1的靶基因，可以抑制细胞生长速度；在非小细胞肺癌细胞中，敲低RBBP7可抑制肺癌细胞的迁移能力。在小鼠卵母细胞中敲低RBBP7的表达后，会影响减数分裂进程和染色体分离；因为RBBP7与调节纺锤体解聚的VCP相互作用，敲低RBBP7干扰第一次减数分裂后期纺锤体的解聚，影响同源染色体的精确分离，导致减数分裂阻滞；此外，敲低RBBP7扰乱了组蛋白乙酰化水平，影响减数分裂染色体乘客复合体(CPC)的正确定位，也会导致减数分裂阻滞。雄性大鼠减数分裂和精子发生的表达谱研究中，RBBP7被认为可能是调节减数分裂候选基因。与RBBP7互作的基因中，如RBBP7的上游基因WT1调控睾丸中Sertoli细胞的细胞极性，小鼠中缺失WT1导致生殖细胞死亡，输精管中仅有Sertoli细胞。尽管对RBBP7 的研究取得了很多的进展，但是临床上RBBP7突变引起男性生精障碍导致男性不育症还未见报道。
[0004]RBBP7蛋白在多个物种间保守，并且在哺乳动物睾丸中高表达。RBBP7在精子发生中的生物学功能和相关分子机制仍然不清楚。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供RBBP7作为分子标志物在诊断男性不育疾病中的应用，本专利技术发现特发性非梗阻性无精子症(NOA)的发生与RBBP7基因异常或RBBP7基因编码蛋白表达水平异常相关。通过检测RBBP7基因序列或RBBP7蛋白表达水平可明确判断特发性NOA 与
RBBP7基因相关。此外，提供了RBBP7基因在最后一个外显子上发生了突变，其核苷酸序列是RBBP7基因序列的第16863960位的T碱基插入；或其氨基酸序列是RBBP7多肽的第401位氨基酸由W突变成M，且402
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425位氨基酸突变截短成AGE。RBBP7基因及其1 个致病突变位点为现有诊断男性不育症的试剂盒提供了一种新的生物标志物和新的治疗男性不育的靶点。
[0006]本专利技术还提供了诊断男性不育症的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的试剂。
[0007]作为优选方案，所述试剂包括1对引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.4所示。
[0008]作为优选方案，还包括记载有判断标准的载体；所述判断标准可为：如果待测者精子中存在RBBP7突变基因/蛋白，则所述待测者为或疑似为男性不育患者。
[0009]本专利技术还提供了检测RBBP7基因/蛋白异常的检测试剂在制备诊断男性不育症的试剂盒中的应用。
[0010]所述RBBP7基因异常包括以下异常中的至少一种：基因的启动子或者增强子序列突变，基因编码序列存在单或多碱基序列缺失、插入或替换；
[0011]所述RBBP7蛋白表达水平异常包括以下异常中的至少一种：RBBP7蛋白表达减少， RBBP7蛋白提前终止或表达缺失，RBBP7蛋白重要功能域中氨基酸缺失、插入或替换。
[0012]进一步地，RBBP7基因在最后一个外显子上发生半合子突变，其核苷酸序列是RBBP7 基因序列的第16863960位的1个T碱基插入，而导致翻译提前终止；或其氨基酸序列是RBBP7 多肽的第401位氨基酸由W突变成M，且402
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425位氨基酸截短成AGE，提前终止。
[0013]进一步地，所述检测试剂包括用于检测RBBP7蛋白或RBBP7 DNA、mRNA、RNA序列或靶向RBBP7的miRNA。
[0014]本专利技术还提供了RBBP7基因/蛋白作为药物靶点在制备产品中应用，所述产品功能可能如下A1)至A9)中的至少一种：
[0015]A1)预防男性不育；A2)治疗男性不育；A3)提高男性生育能力；A4)促进精子的成熟；A5)促进生精细胞有丝分裂；A6)促进生精细胞减数分裂；A7)降低生精细胞凋亡； A8)促进生精细胞分化；A9)修复生精细胞的细胞周期。
[0016]实验证明，含有RBBP7突变基因/蛋白会导致不能产生精子，生精细胞增殖、分化、凋亡异常，细胞周期阻滞。通过检测RBBP7基因和/或RBBP7蛋白水平，以及RBBP7突变基因/ 蛋白是否产生可以诊断男性不育症的遗传学病因，本专利技术具有重大的应用价值。同时，RBBP7 基因/蛋白的RBBP7的表达水平在NOA患者中显著降低，通过提高RBBP7蛋白活性和/或表达量可以预防和/或治疗男性不育症。
附图说明
[0017]下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。
[0018]图1.一个非梗阻性无精子症家系致病基因的筛选与鉴定；(A)一个非梗阻性无精子症家系，箭头表示先证者，方形表示男性，圆形表示女性，黑色符号表示患病个体。(B)该家系中两NOA兄弟及其父母全外显子组测序筛选致病基因流程图。(C)Sanger测序验证该家族 RBBP7(NM_002893.4,C.1201ins1)变异；母亲RBBP7是杂合子，父亲RBBP7是野生型，两兄弟RBBP7是(NM_002893.4,C.1201ins1)半合子变异。
[0019]图2.该RBBP7突变的家系中2个NOA患者情况；(A)对照和患者(II:1)的睾丸活检样本曲细精管横切面H&a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测RBBP7基因/蛋白异常的试剂在制备诊断男性不育症检测试剂盒的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RBBP7基因异常包括以下异常中的至少一种：基因的启动子或者增强子序列突变，基因编码序列存在单或多碱基序列缺失、插入或替换；所述RBBP7蛋白异常包括以下异常中的至少一种：RBBP7蛋白表达减少，RBBP7蛋白提前终止或表达缺失，RBBP7蛋白重要功能域中氨基酸缺失、插入或替换。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，RBBP7基因在最后一个外显子上发生半合子突变，其核苷酸序列是RBBP7基因序列的第16863960位的1个T碱基插入，而导致翻译提前终止；或其氨基酸序列是RBBP7多肽的第401位氨基酸由W突变成M，且402
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425位氨基酸截短成AGE，提前终止。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述男性不育症检测试剂盒包括用于检测RBBP7蛋白或RBBP7 DNA、mRNA、RNA序列的试剂或靶向RBBP7的miRNA。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测RBBP7 DNA序列的试剂包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：李景平，席咏梅，郑慧梅，金帆，李晨，杨小航，张峰彬，梁忠炎，吴敬根，侯佳汝，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：