本发明专利技术公开了鸭α干扰素及其突变体、制备方法和应用。本发明专利技术将鸭α干扰素进行优化并在其基础上进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变，获得多个抗病毒活性提高的鸭α干扰素突变体。本发明专利技术还涉及所述鸭α干扰素突变体在制备预防或治疗鸭病毒性疾病的药物或试剂中的应用，属于鸭α干扰素突变体的制备及应用领域。本发明专利技术利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达的所述鸭α干扰素突变体的抗病毒活性大幅度提高,能够用于制备预防或治疗鸭病毒性疾病的药物或试剂,对鸭养殖业中具有重大威胁的病毒性传染病具有防御和抑制作用。作用。作用。
【技术实现步骤摘要】
鸭
α
干扰素及其突变体、制备方法和应用
[0001]本申请是以下案件的分案申请，原申请申请日：2019年6月13日，原申请申请号：201910510526.7，原申请专利技术名称：鸭α干扰素及其突变体、制备方法和应用。
[0002]本专利技术涉及一种鸭α干扰素突变体，还涉及一种利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述鸭α干扰素突变体的方法；本专利技术还涉及所述鸭α干扰素突变体在制备预防或治疗鸭病毒性疾病的药物或试剂中的应用，属于鸭α干扰素突变体的制备及应用领域。
技术介绍
[0003]干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗寄生于细胞内细菌、抗肿瘤、调节免疫功能等广泛生物活性的细胞因子。IFN蛋白家族根据其编码基因的序列、染色体定位和受体特异性分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素。Ⅰ型干扰素包括IFN
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α、IFN
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β、IFN
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ω、IFN
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δ、IFN
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ε、IFN
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ζ、IFN
‑
τ等，哺乳动物中主要是IFN
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α和IFN
‑
β。Ⅰ型干扰素具有较强的抗病毒活性，主要通过干扰病毒的复制抑制其增殖，还具有抗肿瘤和免疫调节的功能。Ⅱ型干扰素只有IFN
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γ一个成员，又称为免疫干扰素，主要作用是激活巨噬细胞杀灭微生物。Ⅲ型干扰素是新发现的细胞因子，包括λ1(IL
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29)、λ2(IL
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28a)和λ3(IL<br/>‑
28b)。Ⅲ型干扰素与Ⅰ型干扰素关系密切，但有特殊的生理学功能，如刺激主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子的活化和表达，调节先天免疫和获得性免疫等。由于干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤的活性以及强大的免疫调节作用，现已成为病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点之一。
[0004]干扰素首先在禽类中发现，但与人及其他哺乳动物相比，鸭干扰素分子水平的研究起步较晚，与鸡相比，鸭干扰素方面的研究也相对较少。近年来，家禽病毒感染引起的流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性法氏囊病、鸭瘟、鸭肝炎和马立克等传染性疾病愈演愈烈，每年都会给养禽业带来巨大的经济损失，严重制约了养禽业的健康发展，而如何有效的预防和治疗家禽的病毒性传染病一直是禽病防治和治疗研究中的重点。
[0005]鸭的α干扰素基因最早是由德国研究人员Schultz等于1995年利用已报道的ChIFN
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α基因作为探针经过克隆筛选得到。国内研究人员夏春2000年报道了北京鸭的α干扰素基因，其他研究人员后续报道了番鸭、绍兴鸭、麻鸭等各品种鸭的α干扰素基因，此外研究人员相继报道了重组鸭α干扰素对各种病毒的抵抗作用，Schultz等证实了重组干扰素有抵抗水泡型口炎病毒、A型流感病毒、鸭肝炎病毒和新城疫病毒的作用；周雪等2007年采用带有鸭α干扰素基因的质粒注射樱桃谷鸭后表现出一定的抗鸭瘟强毒感染的能力；Pei Gao等2018年用重组鸭α干扰素治疗2日龄鸭来研究其对高致病性禽流感病毒H5N1的抵抗作用，结果显示与病毒对照组相比试验组的鸭死亡率从60％下降到10％，说明重组鸭α干扰素对2日龄鸭感染禽流感病毒H5N1具有抵抗作用。陈斌从四川麻鸭中克隆IFN
‑
α基因，原核表达后检测其抗VSV活性为150U/ml，比活力为440U/mg，高佩在原核表达系统上分别表达rDuIFN
‑
α、
rDuIFN
‑
γ及rDuIFNα
‑
DuIFNγ，抗VSV活性分别为2.1
×
105U/mg、3.6
×
104U/mg、1.6
×
107U/mg。由于原核表达系统不能对表达的重组蛋白进行复杂的翻译后加工修饰，所表达的鸭α干扰素效价偏低，所以本方法采用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕虫(蛹)体内对鸭α干扰素进行表达，以获得大量优质廉价的重组鸭α干扰素蛋白。
技术实现思路
[0006]本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种鸭α干扰素及鸭α干扰素突变体，所述鸭α干扰素突变体具有高抗病毒活性；
[0007]本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述鸭α干扰素或鸭α干扰素突变体的方法；
[0008]本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供所述鸭α干扰素或鸭α干扰素突变体在制备预防或治疗鸭病毒性疾病的药物或试剂中的用途。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：
[0010]本专利技术首先公开了一种鸭α干扰素，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示：
[0011](a)SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或
[0012](b)与SEQ ID No.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；或
[0013](c)与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性。
[0014]根据家蚕密码子偏好性对鸭α干扰素基因序列进行密码子优化，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转录效率与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变；为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列GCCAAC。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI、SmaI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点；得到新的鸭α干扰素优化序列DuIFN
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α
‑
O，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，优化后的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
[0015]本专利技术进一步公开了一种鸭α干扰素突变体，是将氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的鸭α干扰素突变体进行P2A、L19T、P25L、R35P、D38N、N51D、H64N、L73I、Q80R、D95K、H108D、Q117R、H123Y、R127Q、L136S、R142C、I148T、L159F、D170E或R182C任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体；优选为，将氨基本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种鸭干扰素突变体，其特征在于，将鸭干扰素的氨基酸序列进行L136S氨基酸单位点突变获得所述突变体；其中，所述鸭干扰素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.含有权利要求1所述鸭α干扰素突变体的编码基因的重组载体或重组宿主细胞。3.权利要求1所述鸭α干扰素突变体的编码基因在制备预防或治疗...
【专利技术属性】
技术研发人员：易咏竹，王朋，沈兴家，唐顺明，胡小元，魏珍珍，曾振，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：
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