镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法技术

本发明专利技术公开了一种镰刀菌对3,6

【技术实现步骤摘要】
镰刀菌对3,6
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二氯咔唑生物降解的方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体地说，尤其涉及一种镰刀菌对3,6
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二氯咔唑生物降解的方法。

技术介绍

[0002]卤代咔唑是咔唑环上的氢原子被卤素原子取代的一种化合物。近年来，卤代咔唑在自然 环境中的检出率越来越高，才作为一类新型污染物逐渐引起研究者的重视。
[0003]卤代咔唑在环境中分布广泛，特别是在河流湖泊的沉积物、土壤以及一些生物样品中能 检测出较高浓度的卤代咔唑。基于卤代咔唑的生物累积性、持久性和类二恶英毒性，亟待寻 找关于卤代咔唑的降解及污染环境修复的方法。目前已有关于卤代咔唑光降解及化学氧化分 解等修复方法，但对于修复土壤和沉积物的卤代咔唑污染有一定的局限性。利用微生物降解 有机物的方法不仅成本低，且对环境产生的二次污染较小，近年来，越来越多的人通过筛选 出能够以目标污染物为唯一碳源的降解菌，利用降解菌的代谢活动降解污染物。微生物修复 可以作为修复环境中卤代咔唑污染的有效补充手段，然而目前关于3,6
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二氯咔唑这一污染物 的微生物降解方法仍为空白。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种镰刀菌对3,6
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二氯咔唑生物降解的方法，该方法是从土壤中筛选 降解菌，并将降解菌投放到含有3,6
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二氯咔唑的环境介质中，为3,6
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二氯咔唑的降解提供了 一种更有效的方法，该方法对3,6
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二氯咔唑的去除效果显著。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术是采用以下技术方案实现的：一种镰刀菌对3,6
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二氯咔唑生物降解的方法，该降解方法包括以下步骤：（1）将受3,6
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二氯咔唑污染的土壤加入到 MSM 液体培养基中，筛选出能够以3,6
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二氯 咔唑为唯一碳源生长的菌株；（2）将步骤（1）中筛选的的菌株在LB固体培养基上活化，挑取菌株至已灭菌的LB液体培养基扩大培养，收集扩大培养后的菌体，用已灭菌的MSM液体培养基清洗并重悬若干次， 将最后一次重悬的菌体接种至灭菌的 MSM液体培养基进行培养；（3）对步骤（2）的MSM液体培养基的菌落取样，提取并检测MSM液体培养基中残留的 3,6
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二氯咔唑含量，计算各菌株降解率，直至筛选出 3,6
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二氯咔唑高效降解菌株，将降解菌 保藏备用；（4）利用步骤（3）中保藏的降解菌制成孢子悬液；（5）调整含有3,6
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二氯咔唑的环境介质的PH值为5.0
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9.0，温度20℃
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40℃，并在 上述孢子悬液中加入碳源，然后将孢子悬液接种至含有3,6
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二氯咔唑的环境介质中。
[0006]进一步的，步骤（1）中菌株富集和纯化的方法：在30℃和180 r/min的摇床中培养 5d， 5d 后取5.00 mL富集培养液的上清液转接至新的含100.00 mg/L 3,6
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二氯咔唑的MSM 液体培养基中，重复操作3次，取最后一次富集的培养液1.00 mL加入灭菌的去离子水中，按
照10
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1、10
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2、10
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3的比例进行逐级梯度稀释，吸取稀释后的培养液50.00μL涂布于含3,6
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二氯咔唑100.00mg/L 的MSM固体培养基中，将其倒置于30℃培养箱中培养；待菌落形成后，用灭菌牙签挑取不同形态的单菌落在LB固体培养基中划线，经过反复的挑选分离，直至分离出纯菌。
[0007]进一步的，所述MSM液体培养基的制作方法：以1000mL去离子水计，称取硫酸铵1.00g、氯化钠1.00g、磷酸氢二甲1.50g、磷酸二氢钾0.50g、硫酸镁0.20g，加入1000mL去离子水中溶解，再加入1.00mL微量元素溶液，用氢氧化钠调节pH至7.0左右，121℃高温高压灭菌30 min；所述MSM固体培养基的制作方法：在MSM液体培养基基础上添加琼脂粉制成；所述微量元素溶液的制备方法：以1000 mL去离子水计，称取钼酸钠0.15g、一水硫酸锰0.13g、结晶氯化铝0.05g、氯化锌0.23g、一水硫酸铜0.03g、六水合氯化钴0.42g，加1000mL去离子水溶解，用氢氧化钠或盐酸调节pH至7.0左右。
[0008]进一步的，所述 LB 液体培养基的制作方法：以1000mL去离子水计，向氯化钠 10.00g、酵母浸膏5.00g、蛋白胨10.00g，加1000mL去离子水溶解，用氢氧化钠调节pH 至 7.0左 右，121℃高温高压灭菌30 min；所述LB固体培养基的制作方法：在LB液体培养基基础上添加琼脂粉制成。
[0009]进一步的，步骤（2）中，LB液体培养基扩大培养的条件：在30℃，180r/min的条件下扩大培养3d；收集扩大培养后的菌体的方法：在20℃，5000r/min条件离心5min收集 菌体。
[0010]进一步的，步骤（2）中的MSM液体培养基培养的条件：调整菌液浓度为OD600 = 1.0左右，使培养基中3,6
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二氯咔唑浓度为10.00mg/L，在30℃，180r/min的条件下培养8d。
[0011]进一步的，步骤（3）中降解菌的保藏方法：配制质量分数30%的甘油，取30%的甘油加入冻存管中，将甘油以及冻存管121℃高温高压灭菌30min后，加入与甘油等体积的菌液，将液体充分混匀后密封，冷冻保存在
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40℃的冰箱备用。
[0012]进一步的，步骤（4）中孢子悬液的制备方法：将冻存的菌株冰浴解冻，在无菌室中用灭 菌过的牙签蘸取适量菌液，在PDA固体培养基中进行平板划线，将划线后的平板倒扣在生化培养箱中培养，直至长出丰富的白色分生孢子，用牙签刮取平板表面的孢子至灭菌后的MSM液体培养基，涡旋振荡使菌丝在培养基溶液中分布均匀，使孢子悬液的OD600 = 0.16 ~ 0.165。
[0013]进一步的，所述PDA固体培养基的制备方法：以1000mL去离子水计，取马铃薯 200.00g、葡萄糖20.00g、琼脂粉15.00g，加1000mL去离子水溶解，121℃高温高压灭菌30 min。
[0014]进一步的，步骤（5）中接种环境最适降解条件为：温度为30℃，pH为7.0，孢子悬液 外加碳源为1 g/L蔗糖溶液。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术从土壤中分离得到了一株3,6
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二氯咔唑高效降解菌，经鉴定为镰刀菌，经过降解条件优化，镰刀菌 K1对10.00 mg/L3,6
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二氯咔唑的8d降解率达到84%，为环境中卤代咔唑污染提供了新的修复方法，并且通过对3,6
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二氯 咔唑降解产物的测定，推测镰刀菌K1对3,6二氯咔唑的降解存在脱氯和有角度双加氧两种途径，其中有角度双本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
（2）中，MSM 液体培养基培养的条件：调整菌液浓度为 OD600 = 1.0 左右，使培养基中 3,6
‑ꢀ
二氯咔唑浓度为 10.00 mg/L，在 30℃，180 r/min 的条件下培养 8 d。7.根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6
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二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步骤 （3）中降解菌的保藏方法：配制质量分数 30%的甘油，取 30%的甘油加入冻存管中，将甘油 以及冻存管 121℃高温高压灭菌 30 min 后，加入与甘油等体积的菌液，将液体充分混匀后密 封，冷冻保存在
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40℃的冰箱备用。8.根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6
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二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步骤 （4）中孢子悬液的制备方法：将冻存的菌株冰浴解冻，在无菌室中用灭菌过的牙签蘸取适量 菌液，在 PDA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜仲坤，赵鼎坤，朱鲁生，李冰，王军，王金花，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：