CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物及其构建方法，一种人源化CSF1和/或CSF1R蛋白、人源化CSF1和/或CSF1R基因、CSF1和/或CSF1R基因的靶向载体，以及上述构建方法获得的非人动物及其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将人CSF1和/或CSF1R基因的全部或部分核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CSF1和/或CSF1R蛋白，可以作为人CSF1和/或CSF1R信号机理研究、肿瘤及免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]细胞的分化、发育、增殖乃至活化，均受到多个细胞因子信号的协同作用，其中巨噬细胞集落刺激因子M
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CSF(Macrophage
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colony stimulating factor，又称colony
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stimulating factor 1，CSF1)是骨髓祖细胞分化为单核细胞谱系细胞(monocyte lineage cells)，如巨噬细胞，破骨细胞和小胶质细胞所必须的细胞因子，在单核巨噬细胞的存活、增殖、分化及维持活性促进造血功能中具有重要作用。除了此之外，已有研究表明CSF1在破骨细胞的分化、雌性生殖道细胞的分化、胎盘的形成及血管和淋巴的发育过程也有重要作用，并做为促炎因子参与炎性反应，是肿瘤和炎症的有效标志。
[0003]CSF1R(Colony Stimulating Factor 1Receptor)，又称CD115、C
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FMS、FIM2，是一种单链酪氨酸激酶跨膜受体，属于Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受体家族(RTKⅢ)，由巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞和肿瘤细胞产生，能调节巨噬细胞的形态和运动、促进单核吞噬细胞的增殖和分化，而且还是炎症病灶的趋化因子，在免疫应答中发挥重要作用。CSF1R被CSF1激活后会形成同源二聚体，导致其激酶活性的活化，进而激活包括MAPK/ERK在内的许多细胞内信号通路。当ERK磷酸化时，Elk1(ETS转录因子家族成员)与血清应答元件(SRF)形成复合物，导致大量有丝分裂诱导基因的表达。这种相互作用可以被许多癌症类型所利用以逃避免疫系统监控，例如弥漫型腱鞘膜巨细胞瘤(dt
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GCT)，通过过度表达细胞因子CSF1，驱动肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的发育和存活，进而抑制肿瘤的局部免疫反应。目前已在乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中检测到CSF1R的异常表达。此外，CSF1R信号通路激活的巨噬细胞群还与炎症和骨病等多种疾病的病理学相关。Xu
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Ming Dai等人研究发现CSF1R基因敲除可导致小鼠发生骨质疏松(Xu
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Ming Dai et al.Blood.2002,99(1):111
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120.)；X.Hu等人报道CSF1R在类风湿性关节炎的组织和细胞中高表达，可促进类风湿关节炎滑膜细胞(RA
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FLS)增殖，抑制细胞凋亡并加速细胞周期(X.Hu.etal.Clinical&Experimental Immunology.2019,195(2):237
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250.)。
[0004]随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型。更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源化蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是
最大的挑战(Scheer N.et al.Drug Discov Today；18(23
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24):1200
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11,2013)。
[0005]鉴于CSF1/CSF1R信号通路在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发涉及CSF1/CSF1R信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术利用基因编辑技术，用人的正常或突变基因替换非人动物基因组的同源基因，建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因的非人动物。通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种人源化CSF1蛋白，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的全部或部分和非人动物CSF1蛋白的部分。
[0008]优选的，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
[0009]优选的，所述的非人动物CSF1蛋白的部分为非人动物CSF1蛋白的信号肽和/或胞外区。
[0010]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含至少50个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，例如包含至少50、100、200、300、400、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、464个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，进一步优选的，包含459个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区；优选的，包含N端去除0
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5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，进一步优选的，包含N端去除5个氨基酸的人CSF1蛋白胞外区；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第38
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496位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第38
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496位所示的氨基酸序列；所述的人源化CSF1蛋白还包含人CSF1蛋白跨膜区的全部或部分，优选的，所述的跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第497
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517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第497
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517位所示氨基酸序列；所述的人源化CSF1蛋白还包含人CSF1蛋白胞质区的全部或部分，优选的，所述的胞质区包含与S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化CSF1蛋白，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的部分。2.根据权利要求1所述的人源化CSF1蛋白，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，优选的，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含至少200个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第38
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496位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第38
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496位所示的氨基酸序列；所述的人源化CSF1蛋白还包含人CSF1蛋白跨膜区的全部或部分，优选的，所述的跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第497
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517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第497
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517位所示氨基酸序列；所述的人源化CSF1蛋白还包含包含人CSF1蛋白胞质区的全部或部分，优选的，所述的胞质区包含与SEQ ID NO:2的第518
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554位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第518
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554位所示氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的人源化CSF1蛋白，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：A)为SEQ ID NO：2的第38
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554位氨基酸序列的全部或部分；B)与SEQ ID NO：2的第38
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554位氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)与SEQ ID NO：2的第38
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554位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或D)与SEQ ID NO：2的第38
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554位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。4.根据权利要求1
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3任一所述的人源化CSF1蛋白，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：I)为SEQ ID NO：10氨基酸序列的全部或部分；II)与SEQ ID NO：10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；III)与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或IV)与SEQ ID NO：10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。5.一种人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因包含人CSF1基因的部分。6.根据权利要求5所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因编码权利要求1
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4任一所述的人源化CSF1蛋白。7.根据权利要求5或6所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因包含人CSF1基因的1号至9号外显子的部分；优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分；进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列；8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列。8.根据权利要求5
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7任一所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因
包含非人动物CSF1基因的1号和/或9号外显子；优选还包括非人动物2号外显子的部分和/或8号外显子的部分。9.根据权利要求5
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8任一所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因包含下列组中的一种：(A)为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；(B)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；(C)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。10.根据权利要求5
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9任一所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因转录的mRNA选自下列组中的一种：(i)为SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；(ii)与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；(iii)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或(iv)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。11.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含人CSF1基因的部分，优选的，所述的人CSF1基因的部分包含人CSF1基因的1号至9号外显子的部分，进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分，更优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列；8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，更进一步优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO：5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列一致，优选的，所述的靶向载体还包含5
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臂，优选的，所述的5
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臂与NCBI登录号为NC_000069.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5
’
臂序列与SEQ ID NO：3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：3所示；和/或，所述的靶向载体还包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕锐利，张淑金，赵素曼，刘重慧，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：