一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法技术

本发明专利技术涉及发酵酵母筛选基因技术领域，且公开了一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7

【技术实现步骤摘要】
一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法


[0001]本专利技术涉及发酵酵母筛选基因
，具体为一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法。

技术介绍

[0002]基因(遗传因子)是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列，基因支持着生命的基本构造和性能，储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息，环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程，生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关，它也是决定生命健康的内在因素，因此，基因具有双重属性：物质性和信息性，带有遗传信息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表现，组成简单生命最少要265到350个基因，蛋白质作为基因的重要组成部分十分不易被筛选与发现，现在随着人们对于基因研究的深入，人们开始对多肽进行深入研究，但是目前的研究方法不够完善导致基因研究进程缓慢，为了提高研究效率，现提出一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，该方法的目的是发现pGBKT7
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221的相互作用蛋白。

技术实现思路

[0003](一)解决的技术问题
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，具备以构建到pGBKT7载体上的gA9
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221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7
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221相互作用的多肽的优点，解决了当下基因研究效率缓慢，研究方法不够简便的问题。
[0005](二)技术方案
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7
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221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7
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多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液；
[0007]所述酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法具体包含以下步骤：
[0008]S100、将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测；
[0009]S101、文库筛选；
[0010]S102、酵母阳性克隆鉴定及测序比对；
[0011]S103、酵母阳性克隆回转验证。
[0012]优选的，所述将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测包含酵母转化、酵母转化方法、自激活检测，所述酵母转化方法包含以下步骤：
[0013]S200、从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4ml，30℃，225rpm，振
荡培养18
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20h(过夜)，至OD600>1.5；
[0014]S201、转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4
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5h，至OD600＝0.6；
[0015]S202、离心收菌，室温，4000rpm，5min；
[0016]S203、用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0017]S204、用5ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0018]S205、用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；
[0019]S206、每个1.5ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；
[0020]S207、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏，30min；
[0021]S208、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0022]S209、每个转化用200ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板，30℃恒温培养4d。
[0023]优选的，所述文库筛选是用含有pGBKT7
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221诱饵质粒的AH109酵母菌株作为受体制备感受态，将文库质粒pGADT7
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多肽cDNA转入其中，涂SD
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TLH筛选平板，所述文库筛选包含有文库DNA转化方法，具体步骤如下：
[0024]S300、从SD
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T平板挑取单菌种接于液体SD
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T培养基50ml，30℃，225rpm，振荡培养24h；
[0025]S301、转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4
‑
5h，至OD600＝0.6；
[0026]S302、离心收菌，室温，4000rpm，5min；
[0027]S303、用30ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0028]S304、用20ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0029]S305、用10ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
[0030]S306、向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；
[0031]S307、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏1h；
[0032]S308、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用6ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20ul培养物稀释后涂SD
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TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂SD
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TLH，共20块；
[0033]S309、30℃恒温培养3
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7d，观察菌落生长，挑取长出的克隆单菌落，转接到SD
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TLH筛选平板中继续培养3
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5d。
[0034]优选的，所述酵母阳性克隆鉴定及测序比对是为了鉴定SD
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TLH平板中筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。
[0035]优选的，所述酵母阳性克隆回转验证是将划线于SD
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，其特征在于：所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7
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221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7
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多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液；所述酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法具体包含以下步骤：S100、将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测；S101、文库筛选；S102、酵母阳性克隆鉴定及测序比对；S103、酵母阳性克隆回转验证。2.根据权利要求1所述的一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，其特征在于：所述将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测包含酵母转化、酵母转化方法、自激活检测，所述酵母转化方法包含以下步骤：S200、从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4ml，30℃，225rpm，振荡培养18
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20h(过夜)，至OD600>1.5；S201、转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4
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5h，至OD600＝0.6；S202、离心收菌，室温，4000rpm，5min；S203、用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；S204、用5ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；S205、用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；S206、每个1.5ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；S207、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏，30min；S208、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；S209、每个转化用200ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板，30℃恒温培养4d。3.根据权利要求1所述的一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，其特征在于：所述文库筛选是用含有pGBKT7
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221诱饵质粒的AH109酵母菌株作为受体制备感受态，将文库质粒pGADT7
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多肽cDNA转入其中，涂SD
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TLH筛选平板，所述文库筛选包含有文库DNA转化方法，具体步骤如下：S300、从SD
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T平板挑取单菌种接于液体SD
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T培养基50ml，30℃，225rpm，振荡培养24h；S301、转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4
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5h，至OD600＝0.6；S302、离心收菌，室温，4000rpm，5min；S303、用30ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱也，
申请(专利权)人：南京瑞源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：