一种甲状腺过氧化物酶IgM抗体的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种甲状腺过氧化物酶IgM抗体的检测试剂盒，属于生物医药技术领域。所述检测试剂盒包括：

【技术实现步骤摘要】
一种甲状腺过氧化物酶IgM抗体的检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种甲状腺过氧化物酶IgM抗体的检测试剂盒。

技术介绍

[0002]桥本甲状腺炎(HT)是一种十分常见的自身免疫性疾病，起病隐匿，进展快慢不一，临床表现复杂多样，初诊时约20％表现为甲状腺功能减低，5％为轻度甲状腺功能亢进，大多数为甲状腺功能正常，但由于腺体萎缩、破坏，最终也将发展为甲状腺功能减退。HT发生甲状腺功能减退的概率随病程延长而逐渐增加，甲状腺功能减退发生率每年增加5％
‑
7％。甲状腺自身免疫反应的机制是激活的甲状腺抗原特异性T辅助细胞诱导B细胞分泌甲状腺自身抗体，其中甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)是HT的标志性抗体之一。甲状腺过氧化物酶(TPO)其是催化甲状腺激素合成的关键酶，当进入血液后可刺激机体产生TPOAb，通过抗体和补体依赖细胞介导的细胞毒作用导致甲状腺细胞破坏，研究发现血清TPOAb浓度相同的不同患者甲状腺损伤程度及进展不同，仅检测TPOAb水平很难评估病情严重程度。不同HT患者TPO IgG亚型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)分布如何及与甲状腺功能损伤的进展具有怎样的联系，目前国内外相关报道较少，IgM的研究更少。目前IgG亚型及IgM检测方法主要为间接法酶联免疫分析(ELISA)，但ELISA法操作灵敏度、重复性和特异性较差，线性范围窄，且常会有一些相互矛盾的结果。
[0003]放射配体法(RBA)是利用放射性核素标记抗原或抗体，然后与待测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物来进行检测的分析法。该方法灵敏度高、特异性强、精密度和准确度高，是医学研究的重要方法。因此，有必要开发高性能的RBA检测试剂盒取代ELISA法检测TPO IgG各亚型或IgM。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种甲状腺过氧化物酶IgM抗体的检测试剂盒。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种甲状腺过氧化物酶IgM抗体的检测试剂盒，包括：
125
I标记的人甲状腺过氧化物酶，2
‑
巯基吡啶琼脂糖。
[0007]进一步地，上述检测试剂盒还包括TBST缓冲液和牛血清白蛋白。
[0008]进一步地，上述检测试剂盒还包括阳性质控血清和阴性质控血清。
[0009]该试剂盒将含有2
‑
巯基吡啶的琼脂糖运用到已有的放射配体法(RBA)检测平台，以
125
I同位素标记的甲状腺过氧化物酶(TPO)蛋白作抗原与待测血清形成抗原抗体复合物，将2
‑
巯基吡啶琼脂糖与抗原抗体复合物混合震荡，利用2
‑
巯基吡啶可直接结合IgM的特点，反复洗涤，洗脱未结合的信号，读取余下抗原抗体复合物的放射性强度，从而计算出样品中IgM抗体的含量指数。
[0010]上述检测试剂盒在制备桥本甲状腺炎检测产品中的应用。
[0011]2‑
巯基吡啶(C5H5NS)是一种有机硫化合物，亲硫性强，含有C5H5NS的琼脂糖是一种亲硫吸附填料，IgM作为迄今为止实际发现的在人体循环系统中的最大抗体，具有特殊的五聚体结构，含硫量较高，包含较多的结合价能及自由巯基。C5H5NS的供电子基和吸电子基可与IgM相互作用，有效的结合这种特殊的最大抗体，但对其他的较小的抗体则几乎不存在这种相互作用。本专利技术首次将含2
‑
巯基吡啶琼脂糖引入RBA检测平台，直接结合IgM，读取抗原抗体复合物的放射性强度(CPM每分钟放射计数)，计算出样品中抗体的含量指数，建立了TPO IgM的直接法检测方案，减少了间接法可能导致的检测中信号的丢失。
附图说明
[0012]图1为TPO IgM的正常人界值判定结果。
[0013]图2为图2TPO IgM在桥本甲状腺炎患者中的分布。
具体实施方式
[0014]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
[0015]实施例1
[0016]一、实验材料
[0017]1、样本来源：
[0018]收集2019年11月至2022年01月在南京医科大学附属第一医院确诊的192例桥本甲状腺炎患者血清储存于
‑
80℃。健康人101例来自招募人群[年龄(25.6
±
5.6)岁；男60例，女41例]；糖耐量检测(OGTT)空腹及2h血糖正常，排除心、脑、肝、肾等慢性及内分泌疾病，无糖尿病家族病史及自身免疫疾病史。所有研究对象均签署知情同意。
[0019]阳性质控血清标本为专利技术人前期科研中6份TPO IgM阳性血清的混合样本，阴性质控血清标本取自于无自身免疫甲状腺炎家族史的健康志愿者。
[0020]2、试剂：
[0021]125
I标记的人甲状腺过氧化物酶(
125
I
‑
TPO，北京北方生物技术研究所)；2
‑
巯基吡啶琼脂糖(17511001，GE)；96孔PVDF板(3504，Corning)；闪烁液(Microscint
‑
20，Perkin
‑
Elmer)；TBST缓冲液(Tris
‑
Base 2.424g，NaCl 8.70g，Tween
‑
20 1.5mL，加蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.4)；抗原缓冲液(TBST缓冲液加牛血清白蛋白0.25mg/250mL)。
[0022]二、实验方法
[0023]1.抗原稀释：取15mL离心管，用抗原缓冲液稀释
125
I
‑
TPO至20000CPM/6mL。
[0024]2.抗原与血清孵育过夜：取96孔平板，每孔各加5μL待测血清，再向每孔加60μL稀释后的抗原，每孔CPM值要求≥20000，每个标本和质控血清均为双复孔，室温震荡混匀1小时，后4℃过夜。
[0025]3.孵育96孔PVDF板：取一个96孔PVDF板，每孔加入150μL抗原缓冲液，4℃过夜。
[0026]4.沉淀抗原抗体复合物：弃去96孔PVDF板孵育液，每孔加25μL，体积比20％的2
‑
巯
基吡啶琼脂糖，依次从96孔平板各孔中取出50μL混合液转移至96孔PVDF板上，4℃冰箱中混匀1h。
[0027]5.放射结合测定：真空泵抽吸去PVDF过滤板各孔中液体，留取沉淀物，每孔中加200μLTBST缓冲液洗涤沉淀物1次，再加150μL缓冲液重复洗涤6次，每孔加入60μL闪烁液，置βCounter计数仪上计数，每孔计数30S，得到每分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲状腺过氧化物酶IgM抗体的检测试剂盒，其特征在于：包括：
125
I标记的人甲状腺过氧化物酶，2
‑
巯基吡啶琼脂糖。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈恒，王晓东，柳卫，郑旭琴，杨涛，赵成程，龚梓晔，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：