一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法，具体涉及基因工程领域。所述方法包括将玉米CENH3基因中N末端的序列替换为玉米H3基因的N末端序列，得初步改造基因1，再将基因1克隆到以Ubiquitin(UBI)为启动子，且含有大分子红色荧光蛋白(RFP)标签的植物过表达载体pCAMBIA3301

【技术实现步骤摘要】
一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法。

技术介绍

[0002]玉米是一种利用杂种优势的模式作物，我国97％以上的玉米播种面积使用的是杂交种。杂种优势的利用中，最为关键的环节是纯系的选育，常用的有两种方法：第一种为系谱法，即通过连续多带的自交或回交，通常需要5
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7年的时间获得纯系；另一种是双单倍体(Double Haploid,DH)育种技术，利用单倍体诱导系诱导产生的单倍体加倍后成为纯合的二倍体，在1
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2年内即可获得纯系。DH育种在玉米商业化育种流程中扮演着越来越重要的角色，与分子育种技术、转基因技术等已成为现代玉米育种的核心技术。
[0003]单倍体，是指细胞内具有配子染色体数目的个体。单倍体只有一套染色体，隐性基因跟显性基因都能在当代显现出来，所以在早代可以进行优良性状的筛选，及时淘汰不良性状，有利于产量、抗性等有利等位基因的快速聚合。单倍体被加倍后，就可以直接得到纯合的个体，无基因分离现象，与常规育种系谱法相比得到纯系的时间短。另外，单倍体育种中由于没有基因互作，通过分子标记辅助选择，可以提高选育的效率及准确性。此外，利用DH系还可以快速产生作图群体、染色体代换系、反向育种亲本和无融合生殖工程等等。
[0004]目前，在玉米DH育种的实际应用中，单倍体后代的获得主要是通过玉米Stock6种质衍生的单倍体诱导系进行母本单倍体的诱导产生。Stock6玉米单倍体诱导系在1959年首次被报道，具有2.3％
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3.2％的母本单倍体诱导率。在随后的数十年里，世界各地的玉米育种家通过杂交或回交，不断对Stock6诱导系进行改良，使玉米单倍体诱导系的诱导率得到显著提升。
[0005]除了基于Stock6种质的单倍体诱导系选育方法之外，CENH3介导的单倍体诱导技术是未来最有可能被应用于商业化育种程序中的另一种单倍体获取手段。CENH3基因编码了着丝粒特异的组蛋白，是核小体组蛋白H3的变异体，对着丝粒在染色体上的定位起重要的作用。目前的研究表明，利用基因工程的手段，通过对玉米、水稻、拟南芥等植物的CENH3基因进行敲除或突变，可以使植株的配子体或孢子体具备诱导产生单倍体后代的能力，从而创制单倍体诱导系。
[0006]然而，以上两种单倍体诱导系的选育或创制方法，仍存在着明显的缺陷。对于通过改良Stock6种质选育玉米单倍体诱导系的方法，目前主要有以下缺点：1、即使通过多年的回交选育，单倍体诱导系的诱导率的提升速度仍然较慢。2、由于受到种质资源的限制，单倍体诱导系的农艺性状改良与单倍体诱导率的提升二者无法做到完全兼顾，导致具有诱导率较高的材料，其农艺性状可能较差，而无法用于商业化育种应用。
[0007]对于通过基因工程改造CENH3基因而创制玉米单倍体诱导系的方法，目前有以下缺点：1、单倍体诱导系的诱导率仍然较低，且创制的诱导系群体中，各单株之间的单倍体诱
导率不稳定。2、由于大部分玉米常规系的遗传背景中没携带颜色标记基因，导致用其创制的诱导系诱导的单倍体的鉴定比较困难。

技术实现思路

[0008]为此，本专利技术提供一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法，以解决现有玉米单倍体诱导率提升缓慢、单倍体鉴定效率低、诱导系农艺性状差等问题。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]根据本专利技术提供的一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]步骤一，将玉米CENH3基因中N末端的序列替换为玉米H3基因的N末端序列，得初步改造基因1，再将基因1克隆到以Ubiquitin(UBI)为启动子,且含有大分子量标签的植物过表达载体pCAMBIA3301
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RFP中，构建形成过表达着丝粒特异融合蛋白的载体UBI:M
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RFP，将该过表达载体转化到玉米受体中，得阳性转化株系LH244
M
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RFP
；
[0012]步骤二，将所述阳性株系与受体亲本玉米CAU5进行杂交1代，随后以CAU5为轮回亲本回交2代，接着再自交至少4代，最后形成具有高诱导率的新型单倍体诱导系。
[0013]进一步的，所述步骤一中，大分子量标签为RFP荧光蛋白。
[0014]进一步的，所述步骤一中，着丝粒特异融合蛋白具体为将玉米着丝粒特异组蛋白CENH3的N端氨基酸序列替换为玉米核小体组蛋白H3的N端氨基酸序列，并在CENH3蛋白的C端连接上大分子量荧光标签RFP的融合表达蛋白。
[0015]进一步的，所述步骤一中，转化采用的是农杆菌浸胚法。
[0016]进一步的，所述步骤一中，玉米受体株系采用的是LH244株系。
[0017]进一步的，所述步骤二中，受体亲本玉米为Stock6来源的玉米单倍体诱导系CAU5。
[0018]本专利技术的培育方法选用玉米CENH3的C端拼接玉米H3基因N端并连接荧光蛋白的目的是：H3与CENH3拼接形成的嵌合基因仍在着丝粒中特异表达，将其导入到玉米中，可以使荧光标记在细胞核中稳定表达。另外，由于拼接了H3蛋白N端序列的CENH3嵌合蛋白可能不具备与野生型CENH3蛋白完全一致的功能，且其C端融合了外源大分子荧光蛋白标签RFP，导致在其整合到着丝粒时，对着丝粒功能产生一定影响，在与来源于母本的天然CENH3蛋白竞争时，可能由于整合到着丝粒上的时间节点滞后，或是在竞争纺锤丝牵拉效率方面不及正常的母本中天然的CENH3蛋白，所以含有拼接CENH3融合蛋白(M
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RFP)的染色体更容易在有丝分裂中滞后而丢失。
[0019]本专利技术具有如下优点：
[0020]本专利技术的培育方法显著提高玉米单倍体诱导系的诱导率，带有荧光标记的玉米单倍体诱导系不仅可以作为单倍体诱导系，使后代中产生单倍体，还可稳定表达荧光融合蛋白，这就大大的简化鉴别过程；提高田间鉴别单倍体的效率并简化鉴别过程。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅
仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0022]本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一，将玉米CENH3基因中N末端的序列替换为玉米H3基因的N末端序列，得初步改造基因1，再将基因1克隆到以Ubiquitin为启动子，且含有大分子量标签的植物过表达载体pCAMBIA3301
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RFP中，构建形成过表达着丝粒特异融合蛋白的载体UBI:M
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RFP，将该过表达载体转化到玉米受体中，得阳性转化株系LH244
M
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；步骤二，将所述阳性转化株系与玉米受体亲本CAU5进行杂交，得到杂交1代，随后继续以CAU5为轮回亲本回交2代，接着再自交至少4代，最后形成具有高诱导率的新型诱导系。2.根据权利要求1所述一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟德璇，金危危，罗海山，黄伟，董小妹，朱敏，杜万里，钟雪梅，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：