绵羊Toll样受体9(TLR9)在绵羊群体抗病育种中的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及绵羊Toll样受体9(TLR9)在绵羊群体抗病育种中的应用。涉及绵羊TLR9基因03等位基因可作为绵羊抗蝇击分子选育的有效分子标记，用于绵羊群体进行抗病的分子育种实践；本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术针对14个新西兰绵羊群体，收集表型正常和表型上受蝇击的个体基因组DNA样品，采用有效的SNPs检测方法PCR

【技术实现步骤摘要】
绵羊Toll样受体9(TLR9)在绵羊群体抗病育种中的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及绵羊Toll样受体9(TLR9)在绵羊群体抗病育种中的应用。

技术介绍

[0002]蝇击是一种以中性粒细胞增加为特征的细胞免疫性疾病。导致抗中性粒细胞免疫反应的最初事件尚不清楚。先天免疫系统的主要作用之一是识别和确定抗原的性质，这种能力被Toll样受体(TLRs)等特定受体所占据，TLR单倍型和核苷酸替换与各种疾病易感性之间存在相关性。TLR9可以识别细菌和病毒的CpG基序，它强大的免疫刺激作用似乎对慢病毒治疗很有希望。
[0003]蝇击是影响绵羊产业的一个世界性问题，由于它影响动物福利和生产性能，会造成巨大的经济损失，包括羊毛和产品的减少，以及治疗和预防成本的增加。蝇击发病率与环境因子有关且是多变量因子。然而，有几个因素使羊个体易受蝇击，如绵羊的毛、皮肤和免疫反应的变异(Smith et al.,2010)，对于后者，动物的免疫系统识别异物(抗原)，并使用各种方法破坏或灭活它们(Takeda et al.,2003)，在蝇击的背景下，已经证实羊的免疫系统可以识别蝇幼虫的异体成分，并对其产生免疫反应(MacDiarmid et al.,1995)。因此，免疫应答基因可能在蝇击的恢复力和易感性方面发挥重要作用，特别是那些支持炎症和超敏反应产生的基因。识别与这些因素和寄生虫病易感性相关的基因，将可能允许羊群进行基因改良，以适应蝇击，从而减少其对羊产业的影响。
[0004]先天免疫细胞表达多种模式识别受体(PRRs)，包括负责识别病原体相关分子模式(PAMPs)和诱导炎症免疫反应的Toll样受体(TLRs)(Romani,2011；Kumagai and Akira,2010；Takeuchi and Akira,2010)。TLRs广泛表达于体细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞(Kang et al.,2011)。目前至少发现了11个TLR,包括跨膜受体(TLR1,TLR2,TLR4,TLR5,TLR6,and TLR11)和细胞内(TLR3,TLR7,TLR8,and TLR9)(Hayashi et al.,2001；Werling et al.,2009)，有趣的是，哺乳动物内部的TLR数量(如小鼠拥有12个)以及它们在进化过程中的出现并不是守恒的。TLR9基因位于人的第3染色体p21.3，长度约5kb，有2个外显子，主要编码区位于第2外显子。TLR9在免疫系统的不同细胞中表达，如树突状细胞、B淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞，并产生细胞因子，如干扰素(type
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I)和白细胞介素12(Selvaraj et al.,2010)，这归因于许多生物学作用，如凋亡和抗菌活性(Hashemi
‑
Shahri et al.,2014)。越来越多的研究表明，人类不同TLR蛋白上的单核苷酸多态性(SNPs)与感染易感性的改变有关(Skevaki et al.,2015)。TLR9的遗传多态性在人上(Mukherjee et al.,2019)研究较多，动物上的研究仅见绵羊(Zhou et al.,2008)、马(Manuja et al.,2019)、斑马(Smith et al.,2020)等报道。单核苷酸多态性的关系在人类与疾病易感性TLR9识别广泛，横跨克罗恩病(et al.,2004)，红斑狼疮(Wang et al.,2016)和疟疾(Omar et al.,2012)、塔拉菌病(Wang et al.,2021)，所以，研究TLR9基因遗传多态性与疾病的关系，可以帮助我们更加深入地理解动物感染疾病的发病机理，尤
其对免疫性疾病的发展具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供绵羊Toll样受体9(TLR9)在绵羊群体抗病育种中的应用，绵羊Toll样受体9(TLR9)可作为绵羊抗蝇击分子选育的有效分子标记，用于绵羊群体进行抗病分子的育种实践。
[0006]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术针对14个新西兰绵羊群体，收集表型正常和表型上受蝇击的个体基因组DNA样品，采用有效的SNPs检测方法PCR
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SSCP，检测绵羊TLR9基因的遗传多态性，分析了绵羊群体TRL9单倍型与蝇击之间的相关性关系。
附图说明
[0007]图1为本专利技术中TLR9突变体外显子2区的PCR
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SSCP模式图；
[0008]图2为本专利技术中绵羊TLR9外显子2序列变异图。
具体实施方式
[0009]研究绵羊群体TRL9单倍型与蝇击之间的相关性关系
[0010]1材料与方法
[0011](1)实验动物
[0012]从2015年到2017年三年共采集了311只绵羊样品。在这些绵羊中，有177只发生过蝇蛆病或蝇蛆病后正在恢复。这些绵羊来自新西兰各地的商业农场和种羊场，品种包括:美利奴羊、科里代尔羊、佩伦代尔羊、罗姆尼羊、林肯羊、库普沃斯羊、多尔塞特羊、特塞尔羊、芬羊、多塞特唐羊、萨福克羊、南萨福克羊、什罗普郡羊以及各种杂交绵羊群体。这些羊来自农场，那里的农民使用了各种管理措施来控制蝇蛆病。
[0013](2)蝇击的识别
[0014]有蝇蛆病的绵羊和那些已经患过蝇蛆病的绵羊是在剪羊毛或在圈舍中被识别出来。当这些羊的皮肤上可以看到幼虫时，它们被诊断为有活跃的蝇击，而且它们的羊毛变色并且有难闻的气味。绵羊有蝇击被确定是通过无毛区皮肤呈粉红色，明显蛆损伤和片状瘢痕组织，皮肤干燥，被幼虫损伤，或从蝇击中恢复过来，被识别的原因是在被击打的地区有较短的羊毛，并且经常在这个地区有片状的皮肤。
[0015](3)血液采集
[0016]利用FTA(Whatman,Middlesex,UK)采集绵羊基因组DNA，用于PCR扩增的绵羊基因组DNA FTA卡片使用Zhou等人(2006)描述的两步程序。
[0017](4)绵羊TLR9基因引物设计
[0018]PCR引物与Zhou et al.(2008)描述的相同，利用PCR引物扩增了羊TLR9外显子2的一部分，该外显子含有假定的CpG
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DNA结合域。引物为TLR9
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up(5'
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ttcgtggacctgtcggac
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3')和TLR9
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dn(5'
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ctggctgttgtagctgag
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3')。这些引物由Integrated DNA Technologies公司(Coralville,IA,USA)合成。以之前分型的基因组DNA样本作为标准，以确定PCR
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SSCP分型(Zhou et al.，2008)。
[0019](5)绵羊TLR9的PCR
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SSCP分析及基因分型
[0020]进行PCR扩增包含基因组D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.绵羊Tol l样受体9(TLR9)的等位基因03...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀，周辉通，罗玉柱，胡江，王继卿，李少斌，沙玉柱，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：