一种多肽及在促进人自然杀伤细胞增殖并制备人自然杀伤细胞培养基中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多肽及在促进人自然杀伤细胞增殖并制备人自然杀伤细胞培养基中的应用。自然杀伤细胞是抗肿瘤及病毒的固有免疫细胞，在天然免疫中扮演着重要的角色，在早期抗肿瘤和免疫监视方面也具有重要的作用，并且无需抗原特异性识别就可以直接杀伤肿瘤细胞。由于自然杀伤细胞在人体的数量较少，限制了大规模的研究实验。本发明专利技术多肽具有促进人自然杀伤细胞增殖的作用，可用于开发制备促进人自然杀伤细胞体外增殖的培养基。杀伤细胞体外增殖的培养基。杀伤细胞体外增殖的培养基。

【技术实现步骤摘要】
一种多肽及在促进人自然杀伤细胞增殖并制备人自然杀伤细胞培养基中的应用


[0001]本专利技术属于生物化学领域，涉及多肽及自然杀伤细胞培养，具体涉及一种多肽及在促进人自然杀伤细胞增殖并制备人自然杀伤细胞培养基中的应用。

技术介绍

[0002]20世纪70年代初期，研究者在淋巴细胞中发现了自发性的细胞毒作用，找到了新的淋巴细胞亚群，将其命名为自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)。自然杀伤细胞是抗肿瘤及病毒的固有免疫细胞，在天然免疫中扮演着重要的角色，在早期抗肿瘤和免疫监视方面也具有重要的作用，并且无需抗原特异性识别就可以直接杀伤肿瘤细胞。由于自然杀伤细胞在人体的数量较少，限制了大规模的研究实验。研究其细胞生物学特征，并在体外扩增获得大量高纯度的NK细胞成为了热点问题。
[0003]多肽是氨基酸连结成的化合物，由肽键相连，通常指的是由三个或三个以上氨基酸组成的化合物。多肽可包括活性多肽和人工合成多肽，活性多肽作为蛋白质水解产物，具有一定生理作用。人工合成多肽可以根据需要自由控制氨基酸连接顺序，为构建多肽库提供了可能，成为活性筛选的重要来源。
[0004]基于促进人自然杀伤细胞增殖的多肽的发现，特提出本专利技术创造。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是克服现有技术的不足，提供一种多肽及在促进人自然杀伤细胞增殖并制备人自然杀伤细胞培养基中的应用。
[0006]本专利技术目的通过下述技术方案得以实现：
[0007]一种多肽，氨基酸序列为RNDWTMDEQ。
[0008]上述多肽在促进人自然杀伤细胞体外增殖中的应用。
[0009]上述多肽在制备促进人自然杀伤细胞体外增殖的培养基中的应用。
[0010]有益效果：
[0011]本专利技术提供的多肽具有促进人自然杀伤细胞增殖的作用，可用于开发制备促进人自然杀伤细胞体外增殖的培养基。
附图说明
[0012]图1为多肽的液相检测图；保留时间8.273min，HPLC纯度95.327％。
[0013]图2为NK细胞分离培养的流式鉴定图，代表NK细胞的CD3
‑
CD56+表型比例显著升高。
[0014]图3为westernblot检测结果，多肽J组NK细胞中杀伤力相关蛋白表达明显升高。
具体实施方式
[0015]以下实施例仅用于具体介绍本专利技术的实质内容，但不以此限定本专利技术的保护范围。
[0016]一、实验材料
[0017]序列为RNDWTMDEQ(Sequence NO.1)的多肽J由南京肽谷生物科技有限公司采用常规固相合成法合成。多肽J的分子式为C
48
H
71
N
15
O
19
S，分子量为1194.23，质谱检测到分子离子峰[M+H]+
1195.2。HPLC纯度95.327％，见图1。
[0018]NK细胞培养基，赛德特生物制药有限公司(主要组成成分为RPMI 1640、IL
‑
15、IL
‑
2、SCF，仅用于人淋巴细胞中分离的NK细胞的体外扩增培养，不具备对细胞的选择、诱导、分化功能)；RPMI 1640培养基和胎牛血清，GIBCO公司。
[0019]MTT试剂和单抗以及Westernblot一抗、二抗，碧云天。
[0020]二、实验方法
[0021]1、NK细胞分离培养
[0022]按照外周血分离培养NK细胞的操作规程，取健康志愿者外周抗凝血100mL，分离单个核细胞，用NK细胞培养基重悬接种于6孔板中于37℃、5％CO2条件培养，每2天半量换液1次，并调整细胞培养密度为5
×
104/mL。收集培养14d的NK细胞进行后续实验。取适量加入PerCP
‑
Cy5.5标记的CD3、FITC标记的CD56检测CD3
‑
CD56+表型细胞的比例。
[0023]2、MTT法检测NK细胞的体外增殖活性
[0024]取培养14d的NK细胞消化，用RPMI 1640完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)重悬后按5
×
103细胞/孔接种于96孔培养板中，每孔100μL，分为对照组、多肽J
‑
L组和多肽J
‑
H组，每组6个孔。培养24h后，每孔添加100μL新的培养基继续培养：对照组添加新鲜的RPMI 1640完全培养基，多肽J
‑
L组添加含25μg/mL多肽J的RPMI 1640完全培养基，多肽J
‑
H组添加含50μg/mL多肽J的RPMI 1640完全培养基。继续培养48、72h后分别取出一块培养板，每孔加入20μL 5mg/mLMTT溶液，继续培养4h后，弃上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡5min，自动酶标仪系统上测定波长490nm处吸光度值。
[0025]3、Western blot法检测NK细胞杀伤活性标志蛋白表达水平
[0026]取培养14d的NK细胞消化，用RPMI 1640完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)重悬后按2.5
×
105细胞/孔接种于6孔培养板中，每孔1mL，分为对照组、多肽J
‑
L组和多肽J
‑
H组，每组2个孔。培养24h后，每孔添加1mL新的培养基继续培养：对照组添加新鲜的RPMI 1640完全培养基，多肽J
‑
L组添加含25μg/mL多肽J的RPMI 1640完全培养基，多肽J
‑
H组添加含50μg/mL多肽J的RPMI 1640完全培养基。继续培养48后，收集细胞，裂解细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，在10％的十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶中进行蛋白电泳分离，以GAPDH作为内参，蛋白上样量为30μg。90V恒压流转膜，将凝胶蛋白转至硝酸纤维素(NC)膜上。将NC膜放入含5％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)溶液中室温封闭2h。然后分别加入稀释的一抗溶液(Granzyme B、Perforin、β
‑
actin)4℃孵育过夜。PBST溶液洗膜3次，每次10min，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h。PBST溶液洗膜3次后加入ECL发光液进行显色，然后拍照、分析。
[0027]4、统计学分析
[0028]应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，多组均数比较用单因素方差分析
(ANOVA)，两两组间比较用独立样本t检验，P<0.05为差异有显著性意义。
[0029]三、实验结果
[0030]1、NK细胞分离培养
[0031]CD3
‑
CD56+表型细胞的比例检测结果如图2所示，CD3
‑
CD56+表型比例从本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于：氨基酸序列为RNDWTMDEQ。2.权利要求1所述的多肽在促进人自然杀伤细胞体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈飞，
申请(专利权)人：陈飞，
类型：发明
国别省市：