一种密码子优化的核酸外切酶Ⅲ基因及其表达方法技术

本申请公开了一种编码核酸外切酶Ⅲ的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQ ID NO：02所示的核苷酸序列，本申请还公开了一种包含上述核苷酸序列的重组载体和宿主细胞，及其表达方法和所生产的核酸外切酶Ⅲ的用途，本申请所提供的编码核酸外切酶Ⅲ的基因型和构建的表达载体可作为Exo III规模化生产的靶标而加以应用，具备商业价值。具备商业价值。

【技术实现步骤摘要】
一种密码子优化的核酸外切酶Ⅲ基因及其表达方法


[0001]本申请基因工程
，具体地，涉及一种密码子优化的核酸外切酶III(ExonucleaseⅢ)的基因及其表达方法。

技术介绍

[0002]核酸外切酶III，(ExonucleaseⅢ，简称ExoⅢ)，作为一种来源于E.coli的具有3'
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5'外切酶活性的核酸酶。其可作用于双链DNA底物，从3'OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而在DNA分子群内产生渐进缺失。该酶底物为平末端、5'突出末端双链DNA分子，但也可作用于双链DNA的缺刻处，从3'降解DNA分子，释放5'单核苷酸。对于3'突出末端，尤其是多于4nt的几乎完全不切割，亦不能切割硫代磷酰脂键。另外，核酸外切酶III还具有脱嘌呤/嘧啶
‑
核酸内切酶活性、RnaseH活性和3'磷酸酶活性。其上述活性在基因工程
有着广泛应用。
[0003]天然核酸外切酶III来，提取至E.coli，批量酶制剂生产时，野生型菌株方案及其重组表达方案往往存在表达效率低下，造成所提取的酶的活性偏低，产量偏少，对于大规模生产具有局限性。本专利技术采用蛋白质改造的技术手段，应用于提升靶点性能的领域中。基于生物体的密码子存在简并性特征，本专利技术提供一种密码子优化的核酸外切酶III(ExonucleaseⅢ)的基因及其表达方法。

技术实现思路

[0004]本申请探索大肠杆菌核酸外切酶III(以下也将其简称为“Exo III”)的重组表达方案，Exo III对双链DNA和RNA/DNA杂合体具有特异性的水解性能，因此在探针制备和高通量建库测序中起着不可或缺的作用，通过原核表达系统制备高丰度的蛋白产物就相应成为下游酶制剂开发领域的不二选择，其成本低廉、技术成熟和周期短捷的特征为酶原料的开发提供了便利。
[0005]在此基础上，本申请尝试对Exo III的基因序列进行密码子优化分析，以期在现有基础上进一步提高Exo III的表达水平，得到较野生型序列更为高效的表达菌株，从而实现更大程度降低成本和提高效率的目的。
[0006]本申请采用不同的算法对Exo III进行了优化，并对最终的表达产物含量进行分析，确认了更适配于Exo III的优化方式。
[0007]具体的，本申请采用如下技术方案，
[0008]1、一种编码核酸外切酶Ⅲ的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括如SEQ ID NO：02所示的核苷酸序列。
[0009]2、一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的核苷酸序列。
[0010]3、根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为原核细胞重组表达载体。
[0011]4、根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述原核细胞重组表达载体为选自pET载体系列中的任意一种，优选为pET28b。
[0012]5、一种核酸外切酶Ⅲ的表达方法，其特征在于，所述表达方法中采用了权利要求1中的核酸外切酶Ⅲ的核酸分子序列。
[0013]6、一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求2～5任一所述的重组载体。
[0014]7、根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0015]8、一种核酸外切酶Ⅲ，其是SEQ ID NO：02所示的核苷酸序列编码的。
[0016]9、根据权利要求8所述的核酸外切酶Ⅲ，其是利用权利要求2～5中任一项所述的重组载体或权利要求6或7所述的宿主细胞生产的。
[0017]10、根据权利要求8或9所述的核酸外切酶Ⅲ，其用于制备双脱氧测序的单链底物、定点突变、形成单向嵌套缺失或制备特异性探针。
[0018]专利技术效果
[0019]本申请通过理论计算的方式设计了Exo III编码序列，并结合实验手段进行了表达验证和功能测试，最终确认综合各个因素对基因序列进行优化的方式优于仅仅将密码子置换为高频密码子的方式；并且OPT2基因型和构建的表达载体可作为Exo III规模化生产的靶标而加以应用，具备商业价值。
附图说明
[0020]附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
[0021]图1为野生型(WT)、突变型OPT1、突变型OPT2的Exo III的核苷酸序列比对；
[0022]图2为野生型(WT)、突变型OPT1、突变型OPT2的Exo III的密码子质量等级分布；
[0023]图3为野生型(WT)、突变型OPT1、突变型OPT2的Exo III的表达产物SDS
‑
PAGE图谱；
[0024]图4为突变型OPT2的Exo III和美国NEB公司出售的Exo III的功能测试对比。
具体实施方式
[0025]以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
[0026]如本文所使用的，术语“基因”或“编码序列”是指编码基因产物的体外或体内的核苷酸序列。在一些情况下，基因由或基本上由编码序列组成，即，编码基因产物的序列。在其它情况中，基因包括附加的非编码序列。例如，基因可以或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5
’
非翻译(5
’
UTR)或“前导”序列和3
’
UTR或“非转录尾区(trailer)”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0027]如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链。
[0028]如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。此外，本申请中使用的“基因”也表示相同的含义。
[0029]如本文所使用的，术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码核酸外切酶Ⅲ的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括如SEQ ID NO：02所示的核苷酸序列。2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为原核细胞重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述原核细胞重组表达载体为选自pET载体系列中的任意一种，优选为pET28b。5.一种核酸外切酶Ⅲ的表达方法，其特征在于，所述表达方法中采用了权利要求1中的核酸外切酶Ⅲ的核酸分...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚晓洁，赵军，侯启如，王娟，李志民，
申请(专利权)人：北京安诺优达医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：