重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及医药领域，特别是涉及重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒包括P1结构蛋白和蛋白酶3CD，所述P1结构蛋白和蛋白酶3CD来源于不同的重组肠道病毒A71病毒株。本发明专利技术还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。所述预防手足口病产品为药物组合物，例如为疫苗组合物。本发明专利技术的A71病毒样颗粒的表达量高，且纯化获得VLP可诱导较好的免疫原性，可作为肠道病毒A71的候选疫苗进行产业化生产。化生产。

【技术实现步骤摘要】
重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途


[0001]本专利技术涉及医药领域，特别是涉及重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途。

技术介绍

[0002]手足口病是一种5岁以下儿童常见的婴幼儿传染病，主要临床表现为手、足和口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎、心肌炎等一系列并发症甚至导致死亡。手足口病是由人肠道病毒属的柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10和B组2、5型以及肠道病毒71型和埃可病毒30感染引起的，其中肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16是导致手足口病暴发的主要病原体。目前尚无针对肠道病毒A71的特异性治疗药物，因此预防就成为应对肠道病毒A71导致的手足口病的一种有效方法。疫苗是预防肠道病毒A71感染的最有效的方法，目前在中国已经有三个上市的肠道病毒A71灭活疫苗，可以有效保护儿童免受肠道病毒A71的感染。但是，灭活疫苗仍存在一些缺点，例如表位破坏，不完全灭活和成本高等。
[0003]肠道病毒71属于小RNA病毒科肠道病毒属，是无包膜的二十面立体颗粒，直径约30nm，其基因组是单股正链RNA，两端为保守的非编码区，中间为含有1个开放阅读框的编码区，此编码区又分为P1、P2、P3区。P1的翻译产物可以被病毒蛋白酶3CD加工产生衣壳蛋白亚基VP1、VP0和VP3，并进一步组装成病毒的衣壳。病毒样颗粒(Virus
‑
like particle，VLP)与病毒在形态与组成上相似，可诱导较好的免疫反应，同时具有安全性好和成本低的优点，因此VLP为肠道病毒A71疫苗的开发提供了一种方案。研究表明，共表达肠道病毒A71结构蛋白P1和非结构蛋白3CD后可切割为VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，并进一步组装成肠道病毒A71 VLP，且该VLP可以保护小鼠免受肠道病毒A71致死性攻击。但通过共表达P1和3CD获取的VLP产量较低，较低的产量不利于产业化生产，因此亟需提高VLP的产量。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，用于解决现有技术中的问题。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的P1结构蛋白和蛋白酶3CD的核苷酸，所述多核苷酸编码的P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白酶3CD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
[0006]本专利技术还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述的多核苷酸。
[0007]本专利技术还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。
[0008]本专利技术还提供一种重组肠道病毒A71病毒样颗粒，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒包括P1结构蛋白和蛋白酶3CD。
[0009]本专利技术还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用
途。
[0010]本专利技术还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒和药学上可接受的载体。
[0011]如上所述，本专利技术的重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，具有以下有益效果：将VLP的表达量提高了约6倍，且纯化获得VLP的形态和免疫原性良好，为肠道病毒VLP的产量优化提供了新思路。
附图说明
[0012]图1显示为本专利技术的表达载体示意图，P
AOX1
为AOX1启动子，CYC1 TT为CYC1终止子，3CD
‑
O
和3CD
‑
N
为肠道病毒A71的蛋白酶，P1是肠道病毒A71的结构蛋白，其中3CD
‑
O
和3CD
‑
N
来源于不同株病毒。
[0013]图2显示为本专利技术的不同VLP的表达量比较图，即将筛选得到的A71 VLP
‑
O
高表达株和A71 VLP
‑
N
高表达株进行诱导表达，于诱导后24h和48h收集样品测定目的蛋白含量(VLP)和可溶性蛋白含量(TSP)，纵坐标为目的蛋白比可溶性蛋白，即VLP/TSP。
[0014]图3显示为本专利技术的VLP的电镜分析结果，其中(A)为A71 VLP
‑
O
，(B)为A71 VLP
‑
N
，Bar＝100nm。
[0015]图4显示为本专利技术的VLP的免疫原性，为了方便统计，将OD450nm吸光值大于0.15的最高稀释倍数的倒数定位该样品的特异抗体滴度，横线显示为几何平均值。
具体实施方式
[0016]本专利技术提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的P1结构蛋白和蛋白酶3CD的核苷酸，所述多核苷酸编码的P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白酶3CD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
[0017]如图1所示，所述多核苷酸中编码肠道病毒A71 P1蛋白和蛋白酶3CD的核苷酸的排列顺序为：3CD
‑
P1。
[0018]所述多核苷酸中表达各蛋白的表达框在所述多核苷酸中串联。
[0019]在如图1所示的实施例中，具体的串联方式为启动子
‑
3CD
‑
终止子
‑
启动子
‑
P1
‑
终止子。当然，在其他实施方式中，两个表达框的串联方式也可以是：启动子
‑
P1
‑
终止子
‑
启动子
‑
3CD
‑
终止子。由于各蛋白均为独立的开放阅读框，因此不同的串联方式均能达到与实施例相同的效果。
[0020]在一种实施方式中，编码肠道病毒A71的P1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码肠道病毒A71 3CD的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。
[0021]在一种实施方式中，与SEQ ID NO.5～6所示序列的同源性在95％以上的序列，或与SEQ ID NO.5～6所示序列互补的序列也能达到与本专利技术实施例相同的效果。
[0022]所述多核苷酸的序列为经过密码子优化后得到的序列。
[0023]在一种实施方式中，所述肠道病毒A71的P1结构蛋白的氨基酸序列选自以下任一项：1)如SEQ ID NO:1所示的序列；2)与SEQ ID NO:1所示序列的同源性在95％、96％、97％、98％或99％以上的序列；3)与前两项任一所述的序列互补的序列。
[0024]在一种实施方式中，所述肠道病毒A71 3CD的氨基酸序列选自以下任一项：1)如
SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列；2)与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序列的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的P1结构蛋白和蛋白酶3CD的核苷酸，所述多核苷酸编码的P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白酶3CD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中各核苷酸的排列方式为启动子
‑
3CD
‑
终止子
‑
启动子
‑
P1
‑
终止子。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，编码肠道病毒A71的P1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，编码肠道病毒A71 3CD的核苷酸序列如SEQID NO:5或SEQ ID NO:6所示。5.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括权利要求1
‑
4任一所述的多核苷酸。6.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体还包括表达载体；优选的，所述表达载体为酵母表达载体。7.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。8.一种细胞系，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆伟，王晓黎，刘艳，石娜，张玺，边金，秦松，程飞，杨义，
申请(专利权)人：华淞上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：