一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用，属于基因工程和酶工程技术领域，具体为氨基酸突变位点为环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列SEQ ID NO.2的第33、119、122、216、255、258、394、566位氨基酸之一或两者以上，主要突变体为N33K、N33R、Y119R、Y122E、L216Q、H255Y、E258Y、E258Q、E566H、N33K/Y122E/E258Y/P394R，本发明专利技术中突变体的歧化反应活性相较于野生型明显提高，本发明专利技术对于环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高该酶在医药、食品、生物行业中的应用前景。生物行业中的应用前景。生物行业中的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程
，具体涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用。

技术介绍

[0002]环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyl transfer,CGTase,EC 2.4.1.19)属于α
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淀粉酶家族(糖苷水解酶13_2,GH13_2)，是一种胞外酶，同时也是一种多功能酶，能够以淀粉、麦芽糊精等为底物催化转糖苷反应(歧化、环化和耦合反应)和水解反应。其中，歧化反应是两个不同分子间发生的转糖苷反应，即将直链低聚糖被切断的部分转移到另一受体上。环化反应是分子内发生的转糖苷反应，其原理是将直链麦芽低聚糖上非还原端的O4或C4上的糖苷转移到同一直链还原端的C1或O1上，这是CGTase的特征反应。偶合反应是环化反应的逆反应，可以打开环糊精的环，将糖苷转移到直链麦芽低聚物上。
[0003]CGTase的应用十分广泛，常见的是利用其环化反应把淀粉转化成环糊精。另外，也常利用CGTase歧化反应生成稳定性提高的糖苷化合物，如将小分子的糖转移到蔗糖或果糖上而生产抗龋齿功能偶合糖；对甜菊苷、鼠李糖、芸香苷、L
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抗坏血酸等物质进行糖基化修饰，显著改善其性能。
[0004]现有技术中，CGTase具有较优秀的转糖基性能，可被应用到多个领域之中，但其歧化反应酶活通过突变体很难明显提高。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题是通过对来源于Bacillus sp.G1的β
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CGTase进行改造，以此来获得歧化活性效率提高的突变体。
[0007]本专利技术中所述来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp.G1)的环糊精葡萄糖基转移酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，氨基酸突变位点为环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列SEQ ID NO.2的第33、119、122、216、255、258、394、566位氨基酸之一或两者以上。
[0010]根据本专利技术优选的，所述突变体为：
[0011]第33位的天冬酰胺(N)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，分别命名为N33K、N33R；
[0012]第119位的酪氨酸(Y)突变为精氨酸(R)，命名为Y119R；
[0013]第122位的酪氨酸(Y)突变为谷氨酸(E)，命名为Y122E；
[0014]第216位的亮氨酸(L)突变为谷氨酰胺(Q)，命名为L216Q；
[0015]第255位的组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)，命名为H255Y；
[0016]第258位的谷氨酸(E)突变为酪氨酸(Y)或谷氨酰胺(Q)，分别命名为E258Y或E258Q；
[0017]第394位的脯氨酸(P)突变为精氨酸(R)或谷氨酰胺(Q)，分别命名为P394R或P394Q；
[0018]或第566位的谷氨酸(E)突变为组氨酸(H)，命名为E566H。
[0019]根据本专利技术优选的，所述突变体为第33位的天冬酰胺(N)突变为赖氨酸(K)、第122位的酪氨酸(Y)突变为谷氨酸(E)、第258位的谷氨酸(E)突变为酪氨酸(Y)和第394位的脯氨酸(P)突变为精氨酸(R)，命名为N33K/Y122E/E258Y/P394R。
[0020]上述突变体的编码基因，根据氨基酸的突变位点，在环糊精葡萄糖基转移酶的编码核苷酸序列SEQ ID NO.1上，进行定点突变获得。
[0021]一种重组表达载体，包含上述突变体的编码基因。
[0022]一种重组菌株，包含上述突变体的编码基因。
[0023]上述突变体的编码基因、重组表达载体或重组菌株在制备环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。
[0024]上述突变体在制备偶合糖中的应用。
[0025]上述突变体在制备海藻糖中的应用。
[0026]有益效果
[0027]本专利技术提供的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的歧化反应活性相较于野生型明显提高，本专利技术对于环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高该酶在医药、食品、生物行业中的应用前景。
附图说明
[0028]图1为单点突变基因电泳检测结果图；
[0029]图中：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11泳道分别代表N33K、N33R、Y119R、Y122E、L216Q、H255Y、E258Y、E258Q、P394R、P394Q和E566H位点突变PCR验证条带。
[0030]图2为多点突变基因N33K/Y122E/E258Y/P394R PCR电泳检测结果图。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。
[0032]下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：
[0033]LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，余量水。
[0034]TB培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油4mL/L，余量水。
[0035]环糊精葡萄糖基转移酶催化歧化反应活力的测定方法：
[0036]以50mmol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液为溶剂，分别配制12mM的EPS(4，6
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亚乙基
‑
对硝基苯
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α
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D麦芽七糖苷)和20mM麦芽糖溶液，各取300μL的12mM EPS和20mM麦芽糖溶液置于50℃水浴锅中预热，加入100μL稀释后的酶液，精确反应10min后，加入50μL3M HCl，5min后加入3M NaOH中和，然后加入100μLα
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葡萄糖苷酶于37℃水浴锅静置反应60min以上，加入
100μL 1M Na2CO3溶液将pH调节到8.0以上，最后于401nm测定吸光值。环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活力酶活定义为，每分钟转化1μmol EPS所需要的的酶量。
[0037]实施例1
[0038]野生型环糊精葡萄糖基转移酶的制备及表达
[0039]来源于Bacillus sp.G1的环糊精葡萄糖基转移酶的基因来源于人工合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并构建载体导入大肠杆菌中进行表达，得到野生型环糊精葡萄糖基转移酶。于LB液体培养基中(含100mg/L卡那霉素)培养10h，按体积比5％接种量将种子液接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)，37℃培养2h后加入终浓度0.2m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，氨基酸突变位点为环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列SEQ ID NO.2的第33、119、122、216、255、258、394、566位氨基酸之一或两者以上。2.如权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体为：第33位的天冬酰胺(N)突变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，分别命名为N33K、N33R；第119位的酪氨酸(Y)突变为精氨酸(R)，命名为Y119R；第122位的酪氨酸(Y)突变为谷氨酸(E)，命名为Y122E；第216位的亮氨酸(L)突变为谷氨酰胺(Q)，命名为L216Q；第255位的组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)，命名为H255Y；第258位的谷氨酸(E)突变为酪氨酸(Y)或谷氨酰胺(Q)，分别命名为E258Y或E258Q；第394位的脯氨酸(P)突变为精氨酸(R)或谷氨酰胺(Q)，分别命名为P394R或P394Q；或第566位的谷氨酸(E)突变为组氨酸(H)，命...

【专利技术属性】
技术研发人员：王腾飞，刘学军，蒋艺，刘洪玲，袁海波，黄迪，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：