一种羟苯磺酸钙中遗传毒性杂质的定量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种羟苯磺酸钙中遗传毒性杂质的定量测定方法，本发明专利技术先采用酸性乙腈溶液配制衍生化试剂，既能保证羟苯磺酸钙、2

【技术实现步骤摘要】
一种羟苯磺酸钙中遗传毒性杂质的定量测定方法


[0001]本专利技术属于药物分析领域，具体涉及用柱前衍生化并采用高效液相色谱法分离测定羟苯磺酸钙中杂质的方法。

技术介绍

[0002]羟苯磺酸钙作为长期用于临床的毛细血管保护药，自身结构式中含有对二酚羟基结构，很容易被氧化，一旦与水或空气中的氧气接触，很容易被氧化而产生2
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磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌杂质，即使样品放置于4℃温控进样器内，溶液中2
‑
磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌仍迅速增加，导致样品结果超出限度，且无法判定超限原因为样品本身不合格还是配制过程导致。该杂质具有遗传毒性结构，需要进行控制，且该杂质为新的化合物，国内外未有报道，为本公司合成部自制，具体制备过程如下：
[0003][0004]在室温(20～25℃)、氮气保护、机械搅拌下将浓硫酸(29.4g)缓慢滴加入对苯二酚(20g)的环己烷(100g)溶液中，滴毕，加热至70～80℃反应0.5小时，冷却至室温，分离出环己烷，加入乙腈(200mL)溶解固体，溶清后，控制内温＜30℃下加入二氧化锰(80g)，室温下搅拌反应12小时。反应完毕，将反应液倾入冰无数乙醇中(400mL，2v/v)，过滤除去二氧化锰残渣，所得滤液再加入到冰水中(800mL，4v/v，以反应液体积计)，再采用0.45微米滤膜过滤，所得滤液冻干得到2
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磺酸
‑
1,4
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苯醌黄色粉末状固体。采用核磁共振氢谱、高分辨质谱、电感耦合等离子测定确定了其化学结构，详细图谱参见图1～3。
[0005]另外，羟苯磺酸钙的起始物料氢醌，与羟苯磺酸钙结构相似，自身也易被氧化而产生1,4
‑
苯醌，该组分也具有遗传毒性结构需要进行控制。经查询《The Carcinogenic Potency Database》数据库，1,4
‑
苯醌的TD
50
数据为5.07mg/Kg/d；根据ICH M7指导原则计算杂质限度，1,4
‑
苯醌的TTC(毒理学控制阈值)为5.07μg/d，本品的日最大剂量为1.5g/d，因此制定1,4
‑
苯醌限度均为3.38ppm；2
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磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌与1,4
‑
苯醌结构相似，且均具有相同的警示结构，因此其限度也为3.38ppm。
[0006]因此，为保证药物的安全性，必须对上述两个杂质进行控制。但是2
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磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌与1,4
‑
苯醌两个遗传毒性杂质，属于痕量组分，不易被检出；另外羟苯磺酸钙以及微量杂质氢醌，由于自身基团性质活泼，容易被氧化，而2
‑
磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌与1,4
‑
苯醌具有较强的氧化性，因此四个组分在溶液中无法共存。
[0007]首先对于1,4
‑
苯醌定量，由于1,4
‑
苯醌与羟苯磺酸钙在溶液状态下发生氧化还原反应无法共存，将原料供试品溶液中定量加入1,4
‑
苯醌后，系统适用性溶液中1,4
‑
苯醌未出峰，而2
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磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌与氢醌则明显增加(如图4所示)，可见1,4
‑
苯醌在溶液状态下与羟苯磺酸钙迅速完全反应生成2
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磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌与氢醌，因此不仅无法对1,4
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苯醌的
定量，同时还干扰2
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磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌的定量。
[0008]另外对于2
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磺酸基
‑
1,4
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苯醌定量，由于1,4
‑
苯醌的存在，羟苯磺酸钙溶液中测得的2
‑
磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌，无法明确该组分来源为羟苯磺酸钙本身还是溶液配制过程中的反应产物。同时羟苯磺酸钙溶液配制成溶液后，2
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磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌会不断增加，继续放置，该杂质仍会增加，表明溶液状态下主成分羟苯磺酸钙不稳定，会被不断氧化产生2
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磺酸基
‑
1,4
‑
苯醌，进一步增加了该杂质定量的难度。
[0009]此外在羟苯磺酸钙、2
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磺酸基
‑
1,4
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苯醌、氢醌与1,4
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苯醌四个结构式相近，且极性均较大，在反相液相上保留较弱，出峰时间很短，同时因杂质限度较低，需要将样品液配制很高的浓度，才能满足定量的要求，导致液相色谱图中羟苯磺酸钙峰的峰宽较大，待测杂质会被包含于羟苯磺酸钙主峰内，难以分离(如图5所示)。
[0010]综上，需要开发一种能够有效分离并准确检测羟苯磺酸钙、2
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磺酸基
‑
1,4
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苯醌、氢醌与1,4
‑
苯醌四个组分的方法。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于提供一种羟苯磺酸钙中杂质的定量测定方法，该方法使能够有效分离并准确检测羟苯磺酸钙中2
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磺酸基
‑
1,4
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苯醌与1,4
‑
苯醌两个组分，以保证羟苯磺酸钙原料及制剂的安全性。
[0012]本专利技术所述的羟苯磺酸钙中杂质的定量测定方法，所述杂质为2
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磺酸基
‑
1,4
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苯醌与1,4
‑
苯醌，
[0013]采用液相色谱进行分离测定，供试品相经过衍生化试剂进行衍生化，再加入溶剂配置成供试品溶液；所述的溶剂为10％～80％的乙腈水溶液，所述的衍生化试剂通过如下方法制备获得：取2,4
‑
二硝基苯肼加入体积分数为80
‑
90％的磷酸溶液0.4～0.6ml，再加入乙腈混匀，制得含2,4
‑
二硝基苯肼浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的溶液即为衍生化试剂。
[0014]在一种具体的实例中，本专利技术所述的羟苯磺酸钙中杂质的定量测定方法，所述杂质为2
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磺酸基
‑
1,4
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苯醌与1,4
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苯醌，采用液相色谱进行分离测定，色谱条件如下：
[0015]色谱柱：封端的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
[0016]检测波长为：300nm～400nm；
[001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羟苯磺酸钙中杂质的定量测定方法，其特征在于，所述杂质为2
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磺酸基
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1,4
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苯醌与1,4
‑
苯醌，采用液相色谱进行分离测定，供试品经过衍生化试剂进行衍生化，再加入溶剂配置成供试品溶液；所述的溶剂为10％～80％的乙腈水溶液，所述的衍生化试剂通过如下方法制备获得：取2,4
‑
二硝基苯肼加入体积分数为80
‑
90％的磷酸溶液0.4～0.6ml，再加入乙腈混匀，制得含2,4
‑
二硝基苯肼浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的溶液即为衍生化试剂。2.一种羟苯磺酸钙中杂质的定量测定方法，其特征在于，所述杂质为2
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磺酸基
‑
1,4
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苯醌与1,4
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苯醌，采用液相色谱进行分离测定，色谱条件如下：色谱柱：封端的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；检测波长为：300nm～400nm；流速：0.8～1.2ml/min；柱温：0℃～40℃；流动相：以pH4.5
±
0.5的缓冲盐溶液
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乙腈的混合溶液作为流动相，缓冲盐溶液与乙腈的体积比为(80:20)～(35:65)；2
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磺酸基
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1,4
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苯醌与1,4
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苯醌对照品溶液：取2
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磺酸基
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1,4
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苯醌与1,4
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苯醌，加溶剂制备成二者的混合溶液，加入衍生化试剂1～10ml衍生化1h～24h后，加溶剂配制成0.1～0.2μg/ml的对照品溶液；供试品溶液：取供试品，加入衍生化试剂1～10ml衍生化1h～24h后，加溶剂配制成0.03～0.05g/ml供试品溶液；所述的溶剂为10％～80％的乙腈水溶液；优选的，所述的溶剂为20％～35％的乙腈水溶液，所述的衍生化试剂通过如下方法制备获得：取2,4
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二硝基苯肼加入体积分数为80
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90％的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王益群，范婧，闾慧，吴新明，王砚池，王正泽，钟雪彬，曾滢，李纬，
申请(专利权)人：南京长澳医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：