一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞和组织低温保存液，包括以下组分：基础溶液、腺苷、组氨酸、甘露醇、谷氨酸、白杨素、维生素E、牛磺酸、胰岛素。本发明专利技术低温保存液成分简单明确、成本低廉，安全性高；用本发明专利技术的低温保存液保存的细胞或组织无需冲洗，可直接继续培养、传代或作其它用途，低温保存过程中能有效维持细胞或组织的低代谢状态，且低温保存7天后复苏活率仍然保持在90%以上。以上。以上。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用


[0001]本专利技术涉及细胞保存
，具体为一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用。

技术介绍

[0002]随着医疗技术的发展，细胞治疗手段的进步，细胞及组织保存的技术也面临越来越重要的考验，如何安全、有效保存生物样本成为关键。从采集到实验室研究或临床应用，存在着时间和空间的距离，如何保证细胞及组织样本在储存和运输过程中维持其活性及功能特征的稳定，将决定研究或临床应用结果是否准确有效。同时基于细胞的相关临床治疗和基础研究，例如器官移植、组织/细胞移植、CAR
‑
T（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）、干细胞等，都对于细胞和离体组织的保存和运输提出了巨大的需求。
[0003]原代培养是重要的研究方法，包括贴壁培养、悬浮培养、3D培养等多种方法。但是原代培养的成功率与来源组织样本活性具有极大的相关性。组织离体后，往往需要在短时间内进行处理及培养以提高成功率，一旦样本离体时间超过4小时，就容易导致培养失败或组织细胞活性下降。而目前的细胞或组织保存体系无法较长期地保留细胞与来源组织的活性及其功能，成为原代细胞培养成功的重要障碍。在常温或37℃环境中，细胞内生化反应活跃、代谢旺盛，耗氧高，能耗大，这些生理过程会产生大量氧自由基和脂质过氧化物，引起细胞内环境pH和渗透压变化，造成细胞溶胀和死亡。 因此，我们提出一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种细胞和组织低温保存液，包括以下组分：基础溶液、腺苷、组氨酸、甘露醇、谷氨酸、白杨素、维生素E、牛磺酸、胰岛素。
[0006]进一步的，所述基础溶液包括以下组分：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、柠檬酸、EDTA、蔗糖。
[0007]在上述技术方案中，低温保存液是一种可降低细胞正常生理代谢过程中产生的氧自由基和脂质过氧化物的溶液，使细胞处于低代谢状态，可达到短期保存细胞的目的。
[0008]本专利技术提供了一种可以低温（2
‑
8℃）保存细胞和组织的细胞或组织保存液，成分简单明确，不含任何动物源或人源成分，成本低廉，用本专利技术的低温保存液保存的细胞及组织无需冲洗复苏，可直接继续培养、传代或作其它用途，低温保存过程中能有效维持细胞和组织的低代谢状态，稳定保护长达5
‑
7天。本专利技术的细胞低温保存液，在细胞培养通用的磷酸盐缓冲液基础上，设计独特的配方，添加了柠檬酸、EDTA和蔗糖等，可为细胞提供能量，同时维持细胞内渗透压的平衡，防止细胞内水分过量渗入；添加了腺苷，作为ATP合成的前体物质，是细胞维持基本代谢所需的能量底物；添加了白杨素作为抗氧化剂，与一般的抗氧化
剂相比，具有更佳的氧自由基清除作用；维生素E按一定配比联合使用，意外地发现，与白杨素等成分联合使用具有较好的氧自由基清除作用，有效提高了细胞活率；添加了组氨酸、甘露醇、谷氨酸可解决细胞在低温环境中代谢所造成的酸中毒；添加了牛磺酸及胰岛素，牛磺酸与细胞膜流动性有关，可增加存储过程中细胞膜的稳定性，牛磺酸及胰岛素的使用可调节细胞糖代谢等生理活动，维持细胞渗透压平衡、钙平衡等。通过上述原料的组合，能够最大程度上维持细胞和组织在低温条件下的状态，提高细胞存活率及组织块的克隆形成率；并通过配方组合的优化，本专利技术的低温保存液，提高了细胞存活率，延长低温保存时间，与现有商业化产品比较，使用本专利技术的保存液，可维持间充质干细胞存活7天以上，且细胞活率维持在85%以上。
[0009]进一步的，所述腺苷的添加量为0.01～10g/L，所述白杨素的添加量为0.0001～0.005g/L，所述维生素E的添加量为1～50mg/L，所述组氨酸的添加量为0.01～0.5g/L，所述甘露醇的添加量为1～50g/L，所述谷氨酸的添加量为0.005～0.5g/L，所述牛磺酸的添加量为0.02g～2g/L，所述胰岛素的添加量为0.005g/L～0.5g/L。
[0010]进一步的，所述磷酸氢二钠的添加量为0.15g～10g/L，所述磷酸二氢钾的添加量为0.02g～2g/L，所述氯化钠的添加量为0.8g～15g/L，所述氯化钾的添加量为0.02g～2g/L，所述柠檬酸的添加量为0.01g～1g/L，所述EDTA的添加量为0.01g～1g/L，所述蔗糖的添加量为0.1g～20g/L。
[0011]进一步，作为优选实施方案，所述的基础溶液各成分，所述磷酸氢二钠的添加量为1.15g/L，所述磷酸二氢钾的添加量为0.2g/L，所述氯化钠的添加量为8g/L，所述氯化钾的添加量为0.2g/L，所述柠檬酸的添加量为0.1g/L，所述EDTA的添加量为0.1g/L，所述蔗糖的添加量为10g/L。
[0012]进一步，作为优选实施方案，所述剩余成分：所述腺苷的添加量为0.1g/L，所述白杨素的添加量为0.0005g/L，所述维生素E的添加量为0.005g/L，所述组氨酸的添加量为0.1g/L，所述甘露醇的添加量为30g/L，所述谷氨酸的添加量为0.01g/L，所述牛磺酸的添加量为0.2g/L，所述胰岛素的添加量为0.05g/L。
[0013]在上述技术方案中，磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾均购自Sigma公司，柠檬酸购自阿拉丁（货号：C108871）， EDTA购自sigma公司（货号：03677），蔗糖购自阿拉丁（货号：S112236），腺苷购自阿拉丁（货号：A108806）, 白杨素购自阿拉丁（货号：C110078）, 组氨酸购自Sigma公司（货号：H8000），甘露醇购自Sigma公司（货号：V900116），谷氨酸购自Sigma公司（货号：G1251），牛磺酸购自阿拉丁（货号：T103829），胰岛素购自阿拉丁（货号：I302196）；一种细胞和组织低温保存液，包括以下步骤：A.称取白杨素粉末加入至氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；量取维生素E，加入至无水乙醇中，配制成维生素E母液；B.在无菌环境条件下，取注射水，依次加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、柠檬酸、EDTA、蔗糖，搅拌溶解，得到基础溶液；C.称取腺苷、白杨素母液、维生素E母液、组氨酸、甘露醇、谷氨酸、牛磺酸、胰岛素依次加入步骤B所制基础溶液中，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；D.采用过滤器，对步骤C中的MIX溶液进行无菌过滤，得到低温保存液。
[0014]一种细胞和组织低温保存液的应用，所述的保存液应用于哺乳动物细胞保存。
[0015]一种细胞和组织低温保存液的应用，所述的保存液应用于对离体组织进行原代培养前保存。
[0016]如：间充质干细胞及其组织、293T细胞、Vero细胞、肾脏组织、肿瘤组织、肺组织等。
[0017]进一步的，将细胞和离体组织完全浸入所述低温保存液中，保存于0～15℃环境。
[001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞和组织低温保存液，其特征在于：包括以下组分：基础溶液、腺苷、组氨酸、甘露醇、谷氨酸、白杨素、维生素E、牛磺酸、胰岛素。2.根据权利要求1所述的一种细胞和组织低温保存液，其特征在于：所述基础溶液包括以下组分：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、柠檬酸、EDTA、蔗糖。3.根据权利要求1所述的一种细胞和组织低温保存液，其特征在于：所述腺苷的添加量为0.01～10g/L，所述白杨素的添加量为0.0001～0.005g/L，所述维生素E的添加量为1～50mg/L，所述组氨酸的添加量为0.005～0.5g/L，所述甘露醇的添加量为1～50g/L，所述谷氨酸的添加量为0.005～0.5g/L，所述牛磺酸的添加量为0.02g～2g/L，所述胰岛素的添加量为0.005g/L～0.5g/L。4.根据权利要求3所述的一种细胞和组织低温保存液，其特征在于：所述腺苷的添加量为0.1g/L，所述白杨素的添加量为0.0005g/L，所述维生素E的添加量为0.005g/L，所述组氨酸的添加量为0.1g/L，所述甘露醇的添加量为30g/L，所述谷氨酸的添加量为0.01g/L，所述牛磺酸的添加量为0.2g/L，所述胰岛...

【专利技术属性】
技术研发人员：于宝利，孙芳，陈旭，陈刚，商春华，
申请(专利权)人：依科赛生物科技太仓有限公司，
类型：发明
国别省市：