v-ATPase作为早期阿尔兹海默症生物标志物制造技术

本发明专利技术涉及v

【技术实现步骤摘要】
v
‑
ATPase作为早期阿尔兹海默症生物标志物


[0001]本专利技术涉及早期阿尔兹海默症的诊断领域，尤其涉及v
‑
ATPase作为早期阿尔兹海默症生物标志物中的应用。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer' s disease，AD)是一种与年龄相关的进行性神经系统变性疾病。AD的核心症状是记忆障碍伴有其他认知域的损害，并对正常生活、工作造成影响。AD起病隐蔽、病程呈不可逆发展，致残率高，因此，早期诊治对提高 AD病患生存率、尤其对提高其生存质量意义重大
[1]。
[0003]目前检测早期AD经典生物标志物有β淀粉样蛋白42（Amyloidβ
‑
protein 42，Aβ
42
），总tau（T
‑
tau）和磷酸化tau（P
‑
tau），以及新发现的神经颗粒蛋白及MicroRNA。通常AD患者脑脊液（Cerebro
‑
Spinal Fluid, CSF）中的T
‑
tau 和 P
‑
tau显著增加，Aβ
42
显著减少
[2]、AD患者CSF神经颗粒蛋白显著增加
[3]以及miR
‑
100、miR
‑
1274a和miR
‑
146a在AD中具有显著差异表达
[4]。现有的生物标志物不能满足临床需求，使得寻找早期AD生物标志物已迫在眉睫。
[0004]v
‑
ATPase:是一种依靠水解ATP提供能量来转移质子的多亚基复合物,主要分布于真核细胞内多种细胞器的内膜系统上,在人体的肾,脑,睾丸,内耳,骨骼,皮肤等器官有广泛表达。v
‑
ATPase全酶是由两个亚单位V0和V1构成的多亚基聚合体，V0是含5种亚基（a、d、e、c、c”）的跨膜蛋白，V1位于细胞质，包括8种亚基（A、B、C、D、E、F、G、H）
[5]。ATP6V1A
[6]和ATP6V0A1的突变
[7]会导致v
‑
ATPase不能行使功能，导致溶酶体酸化失败，从而引起自噬小体和自噬溶酶体在脑内大量堆积，引起认知障碍。
[0005]APP/PS1小鼠:可表达突变的人类早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉样前体蛋白(APPswe)融合体，APP/PS1(AD)双转基因小鼠这两个基因的表达都由小鼠朊病毒蛋白启动子启动。人类早老素基因的DeltaE9突变是该基因的第九个外显子缺失产生的，此突变会导致早发性老年痴呆症。对小鼠脑蛋白匀浆进行免疫检测发现，人类早老素蛋白高水平地替代了可检测到的小鼠内源性蛋白。并且，在APP/PS1(AD)双转基因的小鼠脑匀浆中还检测到人源淀粉样前体蛋白。据报道，该双转基因模型鼠在7月龄大脑可见老年斑，随着月龄增加，大脑皮层老年斑数量体积明显增加，9
‑
12月龄小鼠大脑出现与AD患者相似的老年斑
[8]。

技术实现思路

[0006]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种v
‑
ATPase作为诊断早期阿尔兹海默症生物标志物。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了检测尿液v
‑
ATPase水平的试剂在制备诊断早期阿尔兹海默症的试剂或试剂盒中的应用。
[0008]作为本专利技术的一个优选例，所述的检测尿液v
‑
ATPase水平的试剂为ELISA试剂。
[0009]采用上述技术方案的有益效果是：
1.本专利技术通过水迷宫证实4月龄APP/PS1小鼠未出现学习记忆障碍；硫磺素
‑
S染色表明4月龄APP/PS1小鼠未出现Aβ斑块。说明小鼠还未出现AD的表征。
[0010]2.本专利技术通过检测4月龄小鼠尿液中v
‑
ATPase含量，与WT型小鼠相比，APP/PS1小鼠尿液中V
‑
ATPase的含量增加。蛋白免疫印迹（WB）实验检测到4月龄APP/PS1小鼠海马部位的ATP6V1A、ATP6V0a1表达水平降低。
[0011]3.本专利技术4月龄APP/PS1小鼠在淀粉样斑块及学习记忆障碍出现之前，APP/PS1小鼠已经出现了v
‑
ATPase变化。证实v
‑
ATPase可作为早期阿尔兹海默症的生物标志物。
[0012]4.本专利技术采用尿液检测是无创的，优于传统的脑脊液和血液检测。
附图说明
[0013]图1为4月龄APP/PS1小鼠的学习记忆能力。(A)4月龄APP/PS1 小鼠第1
‑
4天平均逃避潜伏期。(B)4月龄APP/PS1小鼠第5天空间探索轨迹图。
[0014]图2为4月龄APP/PS1及WT小鼠海马部位的老年斑沉积。(40
×
，标尺＝200μm)
[0015]图3为APP/PS1小鼠尿液中v
‑
ATPase的含量。(n＝6, APP/PS1 vs WT,*P<0.01)。图4为4月龄APP/PS1小鼠海马V
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ATPase亚基的表达水平。(A) ATP6V0a1,ATP6V1A的代表性条带。(B和C)ATP6V0a1,ATP6V1A的 蛋白表达水平的定量统计。(n＝6,APP/PS1 vs WT,*P<0.05)。
具体实施方式
[0016]下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0017]（一）实施方法：（1）动物分组4月龄雄性APP/PS1小鼠9只，野生型小鼠9只（SPF级），体重(22
±
5g)。所有实验动物均饲养于SPF级动物房，环境安静，相对恒定室温（22
±
1℃）和湿度（55%
±
5%），动物自由饮食饮水。实验前适应性喂养2周。水迷宫后直接进行取材；（2）水迷宫实验4月龄APP/PS1小鼠行Morris水迷宫检测小鼠记忆能力，装置主要由隐藏平台、直径120cm,高度50cm的白色圆盆、自动记录分析系统组成。利用自动分析系统将水盆分为四个象限，隐藏平台始终固定在第一象限或者第三象限，隐藏平台直径60 cm，高29cm，实验执行过程中该平台始终淹没在水下1cm；为期5天迷宫实验分为两个步骤完成：前1
‑
4天为定位航行测试，该步骤中所有小鼠每天均被训练3次，全部训练结束后，记录小鼠在60s内找到隐藏平台的时间，即逃避潜伏期，如果小鼠在规定时间内未找到，引导小鼠找到隐藏平台，并让其停留20s后结束；第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测尿液V
‑
ATPase水平的试剂在制备诊断早期阿尔兹海默症的试剂或试剂盒中的应用。2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂晶，孙广峰，吴亚娟，李其烨，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：