用于增加CRISPR/Cas12f1系统的效率的工程化引导RNA及其用途技术方案

本申请文件提供了具有增强的编辑效率的工程化CRISPR/Cas12f1系统及其用途。具体而言，本申请文件提供了富含U的尾序列，可将所述富含U的尾序列掺入工程化的引导RNA中，以增强CRISPR/Cas12f1系统的编辑效率。富含U的尾序列的特征在于含有丰富的尿苷，并且根据引导RNA的表达环境和实际使用环境，可进一步包含除尿苷之外的其它核酸。本发明专利技术人实验性地阐释了富含U的尾序列的结构、掺入位置及效果，并在本申请文件中予以公开。本申请文件中予以公开。本申请文件中予以公开。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增加CRISPR/Cas12f1系统的效率的工程化引导RNA及其用途


[0001]本公开涉及用于其中将CRISPR/Cas系统、特别是CRISPR/Cas12f1系统用于基因编辑的领域中的技术。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas12f1系统是一种被归类为2类V型的CRISPR/Cas系统。之前的研究(Harrington等，Programmed DNA destruction by miniature CRISPR
‑
Cas14 enzymes，Science 362，839
‑
842(2018))首次报道了作为CRISPR/Cas14的CRISPR/Cas系统，这是一种由古细菌衍生而来的CRISPR/Cas系统。此后，随后的研究(Karvelis等，Nucleic Acids Research，Vol.48，No.9 5017(2020))将CRISPR/Cas14系统归类为CRISPR/Cas12f系统。CRISPR/Cas12f1系统属于V
‑
F1系统(CRISPR/Cas系统中的一个亚型，被归类为2类V型)，并且包括具有Cas14a作为效应蛋白的CRISPR/Cas14a系统。与CRISPR/Cas9系统相比，CRISPR/Cas12f1系统的特征在于效应蛋白的尺寸紧凑。然而，正如之前的研究(Harington等，Programmed DNA destruction by miniature CRISPR
‑
Cas14 enzymes，Science 362，839
‑
842(2018)，US 2020/0190494 A1)所揭示的，CRISPR/Cas12f1系统、特别是CRISPR/Cas14a系统表现出切割单链DNA的能力，但对双链DNA没有或有极低的切割活性，使其在基因编辑技术中的应用受到限制。

技术实现思路

[0003]技术问题
[0004]本公开的方面提供了基因编辑效率提高的工程化的CRISPR/Cas12f1系统。
[0005]本公开的方面提供了工程化的CRISPR/Cas12f1系统，所述工程化的CRISPR/Cas12f1系统具有富含尿嘧啶(U)的尾序列。
[0006]本公开的方面提供了用于工程化CRISPR/Cas12f1系统的工程化的crRNA，所述工程化的crRNA具有富含U的尾序列。
[0007]本公开的方面提供了用于工程化CRISPR/Cas12f1系统的工程化的引导RNA，所述工程化的引导RNA具有富含U的尾序列。
[0008]本公开的方面提供了工程化CRISPR/Cas12f1复合体，所述工程化的CRISPR/Cas12f1复合体用于工程化的CRISPR/Cas12f1系统，所述工程化CRISPR/Cas12f1复合体具有富含U的尾序列。
[0009]本公开的方面提供了具有编码工程化的CRISPR/Cas12f1系统的各组分的核酸序列的载体。
[0010]本公开的方面提供了使用工程化的CRISPR/Cas12f1系统的基因编辑方法。
[0011]本公开的方面提供了工程化的CRISPR/Cas12f1系统的用途。
[0012]技术方案
[0013]在实施方式中，本公开的方面提供了用于CRISPR/Cas12f1系统的工程化的CRISPR RNA(crRNA)，所述CRISPR/Cas12f1系统能够编辑包含靶序列的核酸，所述工程化的CRISPR RNA包含：
[0014]CRISPR RNA重复序列；
[0015]间隔序列，所述间隔序列与所述靶序列互补；以及
[0016]富含U的尾序列，所述富含U的尾序列连接至所述间隔序列的3'末端，
[0017]其中，所述富含U的尾序列由(U
a
N)
n
U
b
表示，
[0018]N为腺苷(A)、尿嘧啶(U)、胞苷(C)和鸟苷(G)中的一种，
[0019]a为1
‑
4的整数，n为选自0、1和2的整数，b为1
‑
10的整数，并且
[0020]所述工程化的CRISPR RNA包含在5'
‑
3'方向上按顺序连接的所述CRISPR RNA重复序列、所述间隔序列和所述富含U的尾序列。
[0021]在实施方式中，本公开的方面提供了具有编码所述工程化的crRNA的序列的DNA。
[0022]在实施方式中，富含U的尾序列可为UUUUUU、UUUUAUUUUUU或UUUUGUUUUUU。
[0023]在实施方式中，所述CRISPR RNA重复序列可为SEQ ID NO：58的序列。
[0024]在实施方式中，本公开的方面提供了能够编辑包含靶序列的核酸的CRISPR/Cas12f1系统的工程化的引导RNA，所述工程化的引导RNA包含：
[0025]tracrRNA序列；
[0026]crRNA序列，所述crRNA序列包含CRISPR RNA重复序列和与所述靶序列互补的间隔序列；以及
[0027]富含U的尾序列，所述富含U的尾序列连接至所述间隔序列的3'
‑
末端，
[0028]其中，所述富含U的尾序列由(U
a
N)
n
U
b
表示，
[0029]N为腺苷(A)、尿嘧啶(U)、胞苷(C)和鸟苷(G)中的一种，
[0030]a为1
‑
4的整数，n为选自0、1和2的整数，b为1
‑
10的整数。
[0031]在实施方式中，所述工程化的引导RNA进一步包含接头序列，所述tracrRNA序列和所述crRNA序列通过所述接头序列连接。
[0032]在实施方式中，所述接头序列可为5'
‑
gaaa
‑
3'。
[0033]在实施方式中，所述富含U的尾序列可为UUUUUU、UUUUAUUUUUU或UUUUGUUUUUU。
[0034]在实施方式中，本公开的方面提供了具有编码所述工程化的引导RNA的序列的DNA。
[0035]在实施方式中，本公开的方面提供了工程化CRISPR/Cas12f1复合体，所述工程化CRISPR/Cas12f1复合体能够编辑包含靶序列的核酸，所述工程化CRISPR/Cas12f1复合体包含Cas12f1蛋白以及工程化的引导RNA，
[0036]所述Cas12f1蛋白属于CRISPR14系统类型；
[0037]所述工程化的引导RNA包含：支架序列，所述支架序列与所述Cas12f1蛋白相互作用；间隔序列，所述间隔序列与所述靶序列互补；以及富含U的尾序列，
[0038]其中，所述富含U的尾序列由(U
a
N)
n
U
b...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于CRISPR/Cas12f1系统的工程化的CRISPR RNA(crRNA)，所述CRISPR/Cas12f1系统能够编辑包含靶序列的核酸，所述工程化的crRNA包含：CRISPR RNA重复序列；间隔序列，所述间隔序列与所述靶序列互补；以及富含U的尾序列，所述富含U的尾序列连接至所述间隔序列的3'
‑
末端，其中，所述富含U的尾序列由(U
a
N)
n
U
b
表示，N为腺苷(A)、尿嘧啶(U)、胞苷(C)和鸟苷(G)中的一种，a为1
‑
4的整数，n为选自0、1和2的整数，b为1
‑
10的整数，并且所述工程化的crRNA的序列包含所述CRISPR RNA重复序列、所述间隔序列和所述富含U的尾序列，它们以5'
‑
3'的方向顺序连接。2.一种DNA，所述DNA具有编码如权利要求1所述的工程化的crRNA的序列。3.如权利要求1所述的工程化的crRNA，其中，所述富含U的尾序列为UUUUUU、UUUUAUUUUUU或UUUUGUUUUUU。4.如权利要求1所述的工程化的crRNA，其中，所述CRISPR RNA重复序列具有SEQ ID NO：58的序列。5.一种用于CRISPR/Cas12f1系统的工程化的引导RNA，所述CRISPR/Cas12f1系统能够编辑包含靶序列的核酸，所述工程化的引导RNA具有包含如下的序列：tracrRNA序列；crRNA序列，所述crRNA序列包含CRISPR RNA重复序列以及间隔序列，所述间隔序列与所述靶序列互补；以及富含U的尾序列，所述富含U的尾序列连接至所述CRISPR RNA序列的3'
‑
末端，其中，所述富含U的尾序列由(U
a
N)
n
U
b
表示，N为腺苷(A)、尿嘧啶(U)、胞苷(C)和鸟苷(G)中的一种，a为1
‑
4的整数，n为选自0、1和2的整数，b为1
‑
10的整数。6.如权利要求5所述的工程化的引导RNA，其中，所述工程化的引导RNA进一步包含接头序列，其中，所述tracrRNA序列和所述crRNA序列通过所述接头序列连接。7.如权利要求6所述的工程化的引导RNA，其中，所述接头序列为5'
‑
gaaa
‑
3'。8.如权利要求6所述的工程化的引导RNA，其中，所述富含U的尾序列为UUUUUU、UUUUAUUUUUU或UUUUGUUUUUU。9.一种DNA，所述DNA具有编码如权利要求5或权利要求6所述的工程化的引导RNA的序列。10.一种能够编辑包含靶序列的核酸的工程化CRISPR/Cas12f1复合体，所述工程化CRISPR/Cas12f1复合体包含：Cas12f1蛋白，所述Cas12f1蛋白属于Cas14家族；以及工程化的引导RNA，所述工程化的引导RNA包含支架序列、间隔序列和富含U的尾序列，所述支架序列与所述Cas12f1蛋白相互作用，所述间隔序列与所述靶序列互补，其中，所述富含U的尾序列由(U
a
N)
n
U
b
表示，N为腺苷(A)、尿嘧啶(U)、胞苷(C)和鸟苷(G)中的一种，并且a为1
‑
4的整数，n为选自0、1和2的整数，b为1
‑
10的整数。
11.一种用于表达工程化CRISPR/Cas12f1复合体的载体，所述工程化CRISPR/Cas12f1复合体能够编辑包含靶序列的核酸，所述载体包含：第一序列，所述第一序列包含编码Cas12f1蛋白的序列；第一启动子序列，所述第一启动子序列可操作地连接至所述第一序列；第二序列，所述第二序列包含编码工程化的引导RNA的序列；以及第二启动子序列，所述第二启动子序列可操作地连接至所述第二序列，其中，所述工程化的引导RNA具有与所述Cas12f1蛋白相互作用的支架序列、与所述靶序列互补的间隔序列以及连接至所述间隔序列的3'
‑
末端的富含U的尾序列，所述富含U的尾序列由(U
a
N)
n
U
b
表示，N为腺苷(A)、尿嘧啶(U)、胞苷(C)和鸟苷(G)中的一种，a为1
‑
4的整数，n为选自0、1和2的整数，b为1
‑
10的整数，其中，所述载体被构建为表达所述Cas12f1蛋白和所述工程化的引导RNA，从而使所述Cas12f1蛋白和所述工程化的引导RNA在细胞中形成CRISPR/Cas1...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书三页说明书六一页序列表一零二页附图九页，
申请(专利权)人：基恩科雷有限责任公司，
类型：发明
国别省市：