本发明专利技术公开一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与应用。该慢病毒载体包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、应答元件微型启动子和荧光蛋白；应答元件微型启动子和位于应答元件微型启动子下游的荧光蛋白形成复合元件，设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上。本发明专利技术通过将该慢病毒组载体以病毒液形式感染宿主细胞株，或是将该慢病毒组载体和表达药物受体的重组载体以病毒液形式感染宿主细胞株，筛选鉴定，得到用于药物活性测定的细胞株。该细胞株含有荧光蛋白，检测药物活性时，无需裂解细胞等繁琐步骤，可直接检测活细胞，从而检测成本低，不需要专门配套检测试剂盒；该细胞株响应强，稳定性好。稳定性好。稳定性好。
【技术实现步骤摘要】
用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与应用
[0001]本专利技术属于药物生物活性测定
，尤其涉及一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与应用。
技术介绍
[0002]药物发现和筛选是创新药物研究的起点，对药物的研究和发展具有决定意义，基于药物筛选模型进行化合物活性筛选是目前药物筛选的主要方法之一。依据筛选模型的差异，药物筛选可以分为生化水平的筛选和细胞水平的筛选。
[0003]生化水平的药物筛选操作比较简单，成本较低，筛选机理主要依据药物与靶标的作用强度，而药物效应又不仅仅取决于其与靶标的作用程度，因而不能很好准确地反映药物的作用机制。细胞水平的药物筛选是依据药物作用机制的一种药物筛选模型，其机理是依据药物作用信号传导通路构建相应的活性模型细胞株，候选化合物与活性细胞株的相应受体相互作用后影响细胞的基因表达变化，从而反映候选化合物的相对活性。
[0004]目前细胞水平的药物筛选平台发展迅速，针对不同药物开发了多种不同机理的活性细胞株，主要有离子通道、G蛋白偶联受体(G Protein
‑
Coupled Receptor，GPCR)和酶类等。基于细胞水平的药物筛选，最重要的是获得高响应强度、稳定的细胞模型，而获得良好的细胞模型需要长时间的筛选及验证。本专利技术提供一种利用慢病毒载体快速构建活性细胞株的方法，可以为细胞水平的药物活性筛选模型的建立提供重要的参考依据。
技术实现思路
[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，专利技术人通过设计并合成应答元件微型启动子(Response elementMini promoter)，将其设置于荧光蛋白(FP)上游，得到REMP
‑
FP复合元件；载体为慢病毒载体，特别为自主灭活型(Self inactivating)慢病毒载体，即慢病毒整合到宿主基因组后，5
’
LTR(long terminal repeat)没有转录功能，且能够阻挡上游启动子序列的转录，因此，应答元件微型启动子的转录活性不受上游启动子活性影响。含有上述REMP
‑
FP复合元件的慢病毒感染并将其基因组整合入宿主细胞基因组，候选药物结合活性细胞模型上药物受体后，激活下游信号转导通路，表达的转录因子结合药物应答元件进而促进荧光蛋白转录表达，通过荧光蛋白表达强度可以反映出候选药物的相对活性。
[0006]从而，本专利技术的首要目的是提供一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，其含REMP
‑
FP复合元件。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体的应用。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供应用上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体制备得到的筛选药物活性的细胞株模型及其应用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术通过下述技术方案实现：
[0010]一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，包括复制缺陷型慢病毒
载体骨架、应答元件微型启动子和荧光蛋白；应答元件微型启动子和位于应答元件微型启动子下游的荧光蛋白形成复合元件，设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上。
[0011]所述的复制缺陷型慢病毒载体骨架优选为自主灭活型慢病毒载体。
[0012]所述的应答元件微型启动子指的是能与转录因子结合后控制基因转录表达的DNA序列，缺少转录因子结合其本身无或很弱的启动转录。
[0013]所述的应答元件包括但不限于CRE(cAMP response element)、S6RE(stat6 response element)等。
[0014]所述的荧光蛋白优选为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
[0015]所述的设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上优选为设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架的多克隆位点上。
[0016]所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，优选通过如下步骤制备得到：以序列如SEQ ID NO.1所示的复制缺陷型慢病毒载体pLenti
‑
GFP为骨架，将应答元件微型启动子构建到复制缺陷型慢病毒载体pLenti
‑
GFP的GFP基因上游，得到用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体。
[0017]所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体在制备筛选药物活性的细胞株模型中的应用。
[0018]一种筛选药物活性的细胞株模型，含有应答元件微型启动子和荧光蛋白；是将上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体包装病毒后转导表达药物受体的细胞株得到。
[0019]所述的表达药物受体的细胞株是表达内源药物受体的宿主细胞或是表达外源药物受体的宿主细胞。
[0020]所述的表达内源药物受体的宿主细胞指的是宿主细胞本身表达有药物受体。
[0021]所述的表达外源药物受体的宿主细胞指的是将能表达外源药物受体的核苷酸序列转入宿主细胞得到的细胞株。
[0022]所述的表达药物受体的细胞株若是表达有荧光蛋白时，那么所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体中的荧光蛋白是与所述的表达药物受体的细胞株的荧光蛋白是不同的，从而背景值低，有利于检测药物活性。
[0023]所述的筛选药物活性的细胞株模型的制备方法，是将所述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体包装病毒后转导表达药物受体的细胞株，优选包括如下步骤：
[0024](1)将上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；
[0025](2)将步骤(1)获得的病毒液感染表达药物受体的细胞株；
[0026](3)对步骤(2)的细胞株筛选鉴定获得可以用于药物活性测定的细胞株模型。
[0027]步骤(1)中所述的包装的方法按本领域采用的慢病毒载体的包装方法即可，优选的步骤如下为：
[0028](a)将所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与包装质粒混合后，得到DNA混合液转染包装细胞；
[0029](b)转染18
‑
20小时后，加入丁酸钠(Sodium butyrate)以增强病毒包装效率，处理10
‑
12小时后弃上清换新鲜无血清培养基；
[0030](c)转染43
‑
50小时后，培养上清过滤，获得含应答元件微型启动子和荧光蛋白的病毒液。
[0031]步骤(a)中所述的包装质粒包括但不限于pRSV
‑
Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G；优选由pRSV
‑
Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G按质量比1:1:1配比得到。
[0032]步骤(a)中所述的用于构建活性细胞株模型的慢病毒载体与所述的包装质粒优选按质量比2：3进行配比。
[0033]步骤(a)中所述的转染方法包括但不限于电击转本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，其特征在于：包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、应答元件微型启动子和荧光蛋白；应答元件微型启动子和位于应答元件微型启动子下游的荧光蛋白形成复合元件，设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上。2.根据权利要求1所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，其特征在于：所述的复制缺陷型慢病毒载体骨架为自主灭活型慢病毒载体；所述的应答元件微型启动子指的是能与转录因子结合后控制基因转录表达的DNA序列，缺少转录因子结合其本身无或很弱的启动转录；所述的应答元件包括但不限于CRE或S6RE；所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白；所述的设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架上为设置于复制缺陷型慢病毒载体骨架的多克隆位点上。3.根据权利要求1或2所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体，其特征在于通过如下步骤制备得到：以序列如SEQ ID NO.1所示的复制缺陷型慢病毒载体pLenti
‑
GFP为骨架，将应答元件微型启动子构建到复制缺陷型慢病毒载体pLenti
‑
GFP的GFP基因上游，得到用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体。4.权利要求1～3任一项所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体在制备筛选药物活性的细胞株模型中的应用。5.一种筛选药物活性的细胞株模型，其特征在于：是将权利要求1～3任一项所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体包装病毒后转导表达药物受体的细胞株得到。6.根据权利要求5所述的筛选药物活性的细胞株模型，其特征在于：所述的表达药物受体的细胞株是表达内源药物受体的宿主细胞或是表达外源药物受体的宿主细胞；所述的表达药物受体的细胞株若是表达有荧光蛋白时，所述的用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体中的荧光蛋白是与所述的表达药物受体的细胞株的荧光蛋白是不同的。7.权利要求5或6所述的筛选药物活性的细胞株模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将上述用于构建筛选药物活性的细胞株模型的慢病毒载体与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；(2)将步骤(1)获得的病毒液感...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺华，陈康月，曹春来，周翠，何秀仪，李靖，
申请(专利权)人：珠海联邦制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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