一种高浓度菌影疫苗灭活方法技术

本发明专利技术涉及高浓度菌影疫苗灭活方法，具体包含以下步骤：a)细菌培养结束后，将罐体温度升高，进行灭活培养；b)间隔8h

A inactivation method of high concentration Bacteroides vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种高浓度菌影疫苗灭活方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及细菌菌影的灭活方法。

技术介绍

[0002]细菌菌影(Bacterial ghosts，BGs)是一种没有细胞浆和核酸的细菌体，是革兰阴性菌被裂解后形成的具有完整细菌结构的细菌空壳，由于细菌菌影的制备过程中没有蛋白变性，菌影保留了与活菌完全一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，从而能够保留与活菌相似的免疫原性，还可同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，交叉保护能力优于灭活疫苗。同时由于BGs不包含遗传物质，只存在细菌空壳，因此不存在返毒、恢复毒力的可能，没有致毒副作用，安全性远远优于活疫苗。
[0003]目前细菌菌影最主要的制备方式为基因工程方法，即通过细菌裂解基因(如噬菌体phiX174的裂解基因E)在细菌细胞膜上形成孔道，使得细菌细胞内容物排出而形成菌影，再利用灭活剂进行二次灭活。然而灭活剂浓度过高会对细菌菌影造成损伤，影响其免疫原性，灭活剂浓度过低则又可能造成细菌病原无法被完全灭活的情况。此外，灭活剂的分解、化学反应等也可能造成灭活不彻底，且会存在分解产物，增大疫苗免疫风险。
[0004]由于细菌残留对疫苗的安全性的影响重大，特别是在布鲁氏菌这种人畜共患病的疫苗产品中，细菌灭活不完全对于动物和人类均有重大安全隐患。因此在保持免疫原性和菌影结构的同时，菌影疫苗中活菌的完全灭活，特别是高浓度菌影疫苗中活菌的完全灭活是现有技术当中菌影制备技术中的难点之一，亟待解决。鉴于此，本专利技术特提出一种高浓度菌影疫苗灭活方法。
专利
技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种高浓度菌影疫苗灭活方法，该灭活方法用于解决高浓度菌影疫苗制备过程中的活菌完全灭活，并保持细菌完整结构和免疫原性的问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：
[0007]一种高浓度菌影疫苗灭活方法，包含以下步骤：
[0008]a)细菌培养结束后，将罐体温度升高，进行灭活培养；
[0009]b)间隔8h
‑
72h更换一次发酵罐。
[0010]上述高浓度菌影疫苗灭活方法中，所述步骤a)罐体温度升高至42℃，100r/min培养。
[0011]上述高浓度菌影疫苗灭活方法中，步骤b)所述更换一次发酵罐的操作步骤为将发酵罐中的全部发酵液收集后打入另一个无菌发酵罐中。
[0012]上述高浓度菌影疫苗灭活方法中，所述步骤b)倒罐间隔时间优选为12h
‑
36h，进一步优选为24h。
[0013]上述高浓度菌影疫苗灭活方法中，所述步骤b)倒罐间隔时间可以是8h、12h、24h、36h、72h，优选为24h。
[0014]进一步地，上述高浓度菌影疫苗灭活方法中抗原灭活培养总时长至少为3日，即72h。
[0015]受限于当下高浓度培养技术的效果，在本专利技术的一些实施方案中，所述灭活处理的菌液浓度为4.5
×
10
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CFU/ml、5.0
×
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CFU/ml、5.5
×
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CFU/ml、6.0
×
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CFU/ml、6.5
×
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CFU/ml、7.0
×
10
10
CFU/ml、7.5
×
10
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CFU/ml、8.0
×
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CFU/ml、8.5
×
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CFU/ml、9.0
×
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CFU/ml、9.5
×
10
10
CFU/ml、10
11
CFU/ml。
[0016]在本专利技术的一些实施方案中，所述的灭活处理的菌液浓度为≥4.5
×
10
10
CFU/ml，随着高浓度培养技术的发展，更高浓度的菌液也适用于本专利技术的灭活方法。
[0017]上述高浓度菌影疫苗灭活方法中，当活菌数下降至0CFU/ml时，停止培养。
[0018]进一步地，上述高浓度菌影疫苗灭活方法还包含菌影制备、培养步骤，所述步骤为：
[0019]A)菌影制备方式为噬菌体E蛋白介导的裂解机制，将噬菌体E基因克隆入含温控元件的PBV220质粒，以PBV220
‑
E为模板扩增TC
‑
E温控裂解元件，将其与广谱质粒pBBR1MCS
‑
2相连，将质粒电转入布鲁氏菌A19株感受态细胞中，经含卡那霉素的培养基筛选培养、鉴定，获得符合预期的布鲁氏菌A19
‑
BG株；
[0020]B)将构建好的A19
‑
BG菌株，进行扩繁培养和种子制备；
[0021]C)将制备好的种子打入发酵罐中，进行细菌放大培养，28℃，300r/min，培养48～56h。
[0022]进一步地，上述高浓度菌影疫苗灭活方法还包含灭活抗原的收集步骤，所述步骤为：倒罐时将无菌发酵罐中的全部发酵产物，打入另一个无菌发酵罐中，并对倒罐完成后的原抗原罐做蒸汽消杀工作，确保罐体无菌。
[0023]进一步地，上述高浓度菌影疫苗灭活方法还包含抗原灭活情况的监测步骤，所述步骤为：每次倒罐时取样，进行活菌计数。
[0024]本申请与现有技术相比，具有以下优点：采用物理方法灭活得到的菌液中完全不含有活细菌，处理后菌株表面有明显空洞，呈空壳状，形态完整，具有良好的免疫能力，且未引入灭活剂，减少其对后续保存和免疫步骤中的影响。同时，专利技术人通过实验，惊奇的发现，本专利技术采用的处理方法能够在菌液培养浓度为4.5
×
10
10
CFU/ml以上时，均能取得完全去除活菌的效果，能够应用于疫苗的大规模工业生产，节约生产成本，降低生物安全风险。
[0025]在本专利技术中，所述的细菌可以为大肠杆菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、胸膜放线杆菌，在本专利技术的一个实施方案中，所述的细菌为布鲁氏菌。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为实施例1中灭活处理前、后菌液OD
600
检测结果
[0028]图2为A19BG菌株生长曲线测定结果
[0029]图3为对比例1中不同制备方法处理后活菌数量检测结果
具体实施方式
[0030]下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高浓度菌影疫苗灭活方法，其特征在于，包含以下步骤：a)细菌培养结束后，将罐体温度升高，进行灭活培养；b)间隔8h
‑
72h更换一次发酵罐。2.根据权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，抗原灭活培养时间总长为3日。3.根据权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，所述步骤b)倒罐间隔时间为12h～36h。4.根据权利要求3所述的灭活方法，其特征在于，所述步骤b)倒罐间隔时间为24h。5.根据权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，菌液浓度≥4.5
×
10
10
CFU/ml。6.根据权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，灭活后的活菌数为0CFU/ml。7.根据权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，所述步骤a)中罐体温度升高至42℃，300r/min培养72h；所述步骤b)中更换一次发酵罐的操作步骤为将发酵罐中的全部发酵液收集后打入另一个无菌发酵罐中。8.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，赵海龙，何传雨，吴冬玲，刘梦志，杨启林，王雨朦，霍新亮，余洪磊，
申请(专利权)人：天康制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：