一种基于ADDomer嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物技术领域，具体涉及一种基于ADDomer嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及应用。一种基于ADDomer嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白是在ADDomer载体VL区、RGD1区和RGD2区中插入以下猪O型口蹄疫病毒抗原表位的任一或串联的任意组合：所述猪O型口蹄疫病毒抗原表位为T细胞表位第16～44位氨基酸、B细胞表位第129～160位氨基酸和B细胞表位第200～213位氨基酸。所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。利用重组蛋白组装成新型嵌合病毒样颗粒，并用于制备亚单位疫苗，免疫BALB/c雌鼠后，可诱导机体产生特异性免疫反应，能有效预防FMDV的感染，对控制和净化我国猪O型口蹄疫具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。

A VLPs based on addomer chimeric porcine foot and mouth disease virus type O antigen epitope and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于ADDomer嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及应用


[0001]本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种基于ADDomer嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及应用。

技术介绍

[0002]口蹄疫(food and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(food and mouth disease virus， FMDV)引起的一种烈性传染性疾病，能够导致牛、羊、猪等偶蹄动物发病死亡。FMD的临床症状主要表现为感染动物的蹄部、口腔黏膜、乳房皮肤等多处发生水泡，进而引发溃烂现象。临床症状最明显的是高产奶牛和集中饲养的猪。FMD平均致死率虽很低，感染动物发病率却为100％，且传播速度极快，引发畜产量减少，将对畜牧业造成极大的经济损失。由于FMD危害极大，影响范围极广，因此，世界动物卫生组织(Office International desEpizoofies，OIE)将其列为“A类烈性传染病”第一位。目前，我国主要以接种灭活疫苗预防FMD感染。但传统的灭活疫苗存在病毒灭活不彻底而引发疫苗毒株流行的危险。正是由于传统灭活疫苗的不安全性加速了口蹄疫新型疫苗的研发。
[0003]完整的蛋白抗原在亚单位疫苗中通常被使用，但存在结构复杂、蛋白表达效率低等问题。抗原表位是蛋白抗原中的短氨基酸序列，更容易被MHC分子识别，与整个蛋白抗原相比，能直接诱导有效的免疫。目前，我国主要流行猪O型口蹄疫，其中研究最多并效果最好的FMDV抗原表位主要位于VP1蛋白。Pan等利用FMDV VP1第21～40aa、141～160aa 和200～213aa插入PPV的VP2外环中，构建重组腺病毒来表达PPV：VLPs(FMDV)，在实验动物中发现无佐剂下可诱导高水平的FMDV特异性体液和细胞免疫。Fang等构建了3个片段，选择O型FMDV VP1结构蛋白中B细胞表位第130～140aa和第141～160aa，以及T细胞表位第16～44aa。以不同方式串联6种多肽，结果发现抗原表位的排序对体内产生中和抗体水平是有相关性的。大量研究结果表明，抗原表位对亚单位疫苗的研发具有广阔前景。本课题组前期研究表明，选用猪O型FMDV O/BY/CHA/2010毒株中VP1蛋白的2个B细胞优势抗原表位(129～160aa和200～213aa)和1个T细胞优势抗原表位(16～ 44aa)串联后表达的重组蛋白能刺激动物机体产生特异性抗体。本专利技术在此基础上，选用这三个优势抗原表位作为研究对象，制备嵌合型VLPs疫苗。
[0004]病毒样颗粒(Virus
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like particles，VLPs)是由一种或多种不含病毒核酸的病毒蛋白组装成的空心颗粒，VLPs能模拟天然病毒诱导机体产生有效的免疫应答，这一特性为新型疫苗的研究提供了基础。近年来，法国SNRS科研团队开发了一种能自组装形成VLPs的纳米元件，并命名为ADDomer。该元件可在其VL区和RGD区嵌入并展示病原体的免疫原性表位，从而组装成VLPs。此外，该元件具备使用Multibac系统快速装配，可展示各种抗原多肽，能自发形成稳定的VLPs，具有类似病毒大小并有免疫原性且不携带遗传物质等优点，被选为代表杆状病毒表达系统的下一代疫苗。
[0005]Multibac表达系统是通过将Bac to Bac系统进一步改造，在保留原来Bacmid的
2：蔗糖梯度离心前的ADDomer
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RBT重组蛋白；3：蔗糖梯度离心后的ADDomer蛋白；4：蔗糖梯度离心后的ADDomer
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RBT重组蛋白)。
[0041]图13电镜观察到的VLPs(92000
×
；标尺：100nm)，a：ADDomer
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VLPs；b： ADDomer
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RBT
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VLPs。
[0042]图14是小鼠血清中FMDV特异性抗体ELISA检测结果。
[0043]图15是小鼠脾脏中T淋巴细胞亚群变化(*代表每组间与PBS组比具有显著差异(p ＜0.05)，其中*代表p＜0.05，**代表p＜0.01；ns代表每组间与PBS组比无显著差异(p ＞0.05))。
[0044]图16是小鼠血清中IL
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2、IL
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4和IFN
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γ检测情况(*代表每组间与PBS组比具有显著差异(p＜0.05)，其中*代表p＜0.05，**代表p＜0.01；***代表p＜0.001；****代表p＜ 0.0001；ns代表每组间与PBS组比无显著差异(p＞0.05))。
具体实施方式
[0045]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0046]实施例中，表达载体pFBDM、大肠杆菌感受态细胞DH10Multibac、DH5a均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存；猪O型口蹄疫灭活疫苗 Re
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O/MYA98/JSCZ/2013株为金宇保灵生物药品有限公司产品；猪口蹄疫阳性血清由广东永顺生物制药股份有限公司馈赠。
[0047]实施例1重组蛋白基因的设计与合成
[0048]根据GenBank中登录的猪O型FMDV O/BY/CHA/2010株(GenBank number： JN998085.1)中选取FMDV VP1蛋白中免疫原性好的一个T细胞优势表位(16～44aa)和两个B细胞优势表位(129～160aa、200～213aa)，所述T细胞表位第16～44位氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，B细胞表位第129～160位氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，B 细胞表位第200～213位氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0049]根据专利号：US201716088905提供的ADDomer序列为VLPs载体，在其两端加上酶切位点后，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0050]选取的猪O型FMDV抗原表位组合之间用“GGGGS”连接子相连，串联B细胞表位 (129～160aa)与T细胞表位(16～44aa)，串联基因命名为B1T；T细胞表位(16～44aa)，基因命名为T；串联T细胞表位(16～44aa)与B细胞表位(200～213aa)，串联基因命名为TB2；用“GGGGS”连接子相连，以VL(B1T)RGD1(T)RGD2(TB2)方式于ADDomerVL区、RGD1区和RGD2区中依次插入上述猪O型FMDV抗原表位，获得重组蛋白 ADDomer
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RBT，其核苷酸序列如SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于ADDomer嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白是在ADDomer载体VL区、RGD1区和RGD2区中插入以下猪O型口蹄疫病毒抗原表位的任一或串联的任意组合：所述猪O型口蹄疫病毒抗原表位为T细胞表位第16～44位氨基酸、B细胞表位第129～160位氨基酸和B细胞表位第200～213位氨基酸。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。3.一种权利要求2所述重组蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。4.一种含有权利要求3所述编码基因的转移载体，其特征在于，所述转移载体是将权利要求4所述重组蛋白的编码基因克隆至表达载体所得，所述表达载体为pFBDM。5.一种含有权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金顶，罗朝唯，颜权辉，丁红星，范双旗，刘家勐，吴珂珂，李玉婉，赵明秋，易琳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：