一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，将猪流行性腹泻G2株在Vero

Construction method of infectious clone of porcine epidemic diarrhea virus

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是一种危害极大的接触性肠道传染病，此疫病的快速传播，给养猪行业带来前所未有的挑战。该疫病由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪的高致死率为重要特征，不同年龄和不同品种的猪群都有易感性，但对于哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的危害要更大，尤其是以哺乳仔猪受害状况最为严重，发病率高达100％，死亡率为30％～80％。除此之外，其他日龄的猪只，虽然易感，但是会随着猪只日龄的增长，死亡率呈下降趋势。
[0003]猪流行性腹泻的预防大致可以从以下四个方面开展：1、被动免疫途径：母猪经免疫PED疫苗后获得的母源抗体，可以从仔猪口腔感染途径给与预防，抗体一般可以持续不超过2周。2、主动免疫途径：主要是通过疫苗接种方式进行免疫。灭活疫苗和弱毒疫苗是主要的PEDV疫苗形式。但是现有临床数据显示，原有的旧毒株G1群(PEDV CV777株)所生产的疫苗已经不能给近年来市场上出现的猪流行腹泻新的变异株(变异毒株(G2群))提供足够的保护。3、有研究发现混合单克隆抗体和卵黄抗体具有微弱的保护作用，干扰素用于猪只上可以一定程度减少体重损失，但该病没有特异性疗法。通过母猪注射疫苗，利用母源抗体可以来保护仔猪，是较好的一种保护方式。4、养殖环境控制：良好的养殖环境越来越受到养殖户的认可，可以通过严格的消毒程序和全进全出等养殖措施提高PEDV的预防效果。但是现在由于国内复杂的养殖环境，严格措施还不能得到有效的实施。
[0004]现在，猪流行性腹泻疫苗在临床中得以应用，包括灭活疫苗和弱毒苗。由于猪流行性腹泻病毒在细胞中不易增殖，导致疫苗的生产效果一直不理想。灭活疫苗只能够产生抗体，防治病毒，却不能去除和消灭病毒；活疫苗由于使用传统的毒株疫苗(PEDV CV777株)已经不能有效的满足客户的需要，客户迫切的需要一种安全、对当前流行性毒株能有效防治的猪流行性腹泻疫苗。另一方面，理想的猪流行性腹泻疫苗应该兼具高安全性与高免疫效力，中国养猪面积幅员辽阔，在不同地区PEDV的流行毒株不完全一致，尤其现在对PEDV毒力起着决定作用的S基因上，发生了很多突变。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法。
[0006]本专利技术以实验室前期构建的PEDV感染性克隆为基础，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC
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PEDV质粒的RBD替换成RBD高频位点改造的突变体，构建流行毒株高保护PEDV疫苗，免疫小鼠后检测改造病毒诱导中和抗体的水平。
[0007]本专利技术的目的采用以下技术方案来实现：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：
[0009]步骤1，选择G2型PEDV毒株(GenBank登录号：KU558701)作为研究对象；
[0010]步骤2，分析G2型PEDV毒株的基因组序列特征，找出G2型PEDV毒株S基因编码氨基酸序列中特有的氨基酸突变区域；
[0011]步骤3，利用基因的克隆和载体构建技术，将PEDV感染性克隆受体结合域(Receptor Binding Domain，RBD)替换成AscI酶切位点；
[0012]步骤4，使用人工细菌染色体技术(BAC)，获取pBAC
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PEDV(ΔRBD::AscI)质；
[0013]步骤5，将提取得到质粒pBAC
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PEDV(ΔRBD::AscI)用AscI酶切线性化；
[0014]步骤6，线性化产物使用乙醇沉淀回收，回收产物与RBD突变体连接得到RBD突变质粒pBAC
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PEDV(mut)，完成猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建。
[0015]优选地，步骤1中，将分离出的猪流行性腹泻G2株在Vero
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CCL81细胞上传至P3代。
[0016]优选地，步骤1中，将感染有G2型PEDV毒株的仔猪的空肠肠道组织样品剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的T
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25单层Vero细胞，孵育1h后，弃去病毒液，用PBS清洗三次细胞后，加入10μg/ml胰酶的MEM培养基，置于37℃、含5％CO2的恒温培养箱中培养7日，观察是否出现细胞病变，如此盲传至细胞出现病变，收集培养物，冻融三次并命名，置
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80℃以下超低温冰箱中保存。
[0017]优选地，步骤3中，利用反向遗传技术，实现了对PEDV的感染性克隆。
[0018]优选地，步骤3中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC
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PEDV质粒的RBD替换成一个AscI酶切位。
[0019]优选地，所述步骤3中，将RBD上游GG与下游CC之间的序列替换成CGCG形成一个AscI酶切位点，替换后的序列如下：GCTTTTGACCTTGACGATGGCGCGCCAAGTATACTATCTATGGCT。
[0020]优选地，步骤4中，以pTargetF质粒为模板，用AscI
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N20
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F/AscI
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N20
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R引物进行PCR扩增sgRNA，以pBAC
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PEDV质粒为模板，分别用AscI
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updonor
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F/AscI
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updonor
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R和AscI
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downdonor
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F/AscI
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downdonor
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R引物扩增上游供体和下游供体，得到一个新的质粒pBAC
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PEDV(ΔRBD::AscI)；
[0021]优选地，所述步骤6中，将连接产物转化TG1，涂布于LB+壮观霉素平板，37℃培养过夜，再通过感受态制备和质粒电转化操作。
[0022]优选地，从上述培养过作的平板上挑取大小中等形态正常的大肠杆菌单克隆至LB+Spe液体培养基，37℃220r/min培养，等菌液培养至肉眼可见混浊时用AscI
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N20
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F/AscI
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downdonor
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R引物进行菌液PCR验证。
[0023]第二方面，构建方法制备得到的猪流行性腹泻病毒感染性克隆。
[0024]本专利技术的有益效果为：
[0025]本专利技术利用反向遗传技术，实现了对PEDV的感染性克隆，感染性克隆中，我们使用人工细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，选择G2型PEDV毒株作为研究对象；步骤2，分析G2型PEDV毒株的基因组序列特征，找出G2型PEDV毒株S基因编码氨基酸序列中特有的氨基酸突变区域；步骤3，利用基因的克隆和载体构建技术，将PEDV感染性克隆受体结合域(Receptor Binding Domain，RBD)替换成AscI酶切位点；步骤4，使用人工细菌染色体技术(BAC)，获取pBAC
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PEDV(ΔRBD::AscI)质；步骤5，将提取得到质粒pBAC
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PEDV(ΔRBD::AscI)用AscI酶切线性化；步骤6，线性化产物使用乙醇沉淀回收，回收产物与RBD突变体连接得到RBD突变质粒pBAC
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PEDV(mut)，完成猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建。2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，将猪流行性腹泻G2株在Vero
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CCL81细胞上传至P3代。3.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，将感染有G2型PEDV毒株的仔猪的空肠肠道组织样品剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的T
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25单层Vero细胞，孵育1h后，弃去病毒液，用PBS清洗三次细胞后，加入10μg/ml胰酶的MEM培养基，置于37℃、含5％CO2的恒温培养箱中培养7日，观察是否出现细胞病变，如此盲传至细胞出现病变，收集培养物，冻融三次并命名，置
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80℃以下超低温冰箱中保存。4.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤3中，利用反向遗传技术，实现了对PEDV的感染性克隆。5.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤3中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC
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PEDV质粒的RBD...

【专利技术属性】
技术研发人员：张满义，梁军，冯泽泰，任新蓉，蒲小峰，
申请(专利权)人：新疆方牧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：