一种无分离体系中细胞外囊泡及其亚型的检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种无分离体系中细胞外囊泡及其亚型的检测方法和应用，本发明专利技术提供一种检测探针，其包括探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ；所述探针Ⅰ的一端标记有生物素，另一端标记有第一识别单元；所述探针Ⅱ的一端标记有荧光染料；所述探针Ⅲ的一端标记有第二识别单元；所述探针Ⅰ与所述探针Ⅱ部分配对，使得所述生物素与所述荧光染料相互靠近；所述探针Ⅰ、所述探针Ⅱ分别与所述探针Ⅲ部分配对，使得所述探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ在检测靶标存在的条件下，通过联合立足作用，杂交形成T型结构。本发明专利技术还提供了相应的检测方法，可以在无分离体系中实现对细胞外囊泡的检测，具有操作简单、检测迅速、灵敏度高、不易受荧光强度波动、荧光漂白的影响等优点。点。点。

Detection method and application of extracellular vesicles and their subtypes in a non separation system

【技术实现步骤摘要】
一种无分离体系中细胞外囊泡及其亚型的检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞外囊泡分析检测
，具体涉及一种无分离体系中细 胞外囊泡及其亚型的检测方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，简称EVs)是一类能被大多数活细胞 分泌具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡，含有细胞特异性的蛋白质、脂质和核 酸，可以作为信号分子传递给其他细胞从而影响其他细胞的功能。细胞外囊泡 中以尺寸较小的外泌体(exosomes)研究较多。研究发现细胞外囊泡能实时动 态地反映肿瘤进展。肿瘤EVs的特异性生物标志物(如蛋白质、脂质和核酸) 均具有肿瘤细胞的特性，不同器官产生的EVs可以作为肿瘤诊断的分子标记。 由于肿瘤具有异质性，患者可能具有相同的病理改变，但可能由完全不同的基 因变化造成，因此肿瘤精准诊断与个性化治疗显得更为重要。作为肿瘤状态实 时动态的反映，肿瘤细胞外囊泡在精准医疗中也有着广泛的应用前景。
[0003]体液中包含的细胞外囊泡是不同器官和细胞产生的EVs集合体，大部分 EVs来源于血液或正常细胞，其中与肿瘤相关的EVs数量十分稀少。如何能够 将与肿瘤相关的EVs区分并检测出来就显得尤为重要。已有研究表明，要满足 肿瘤相关EVs亚型检测的精确度，用单一靶标往往是不够的，一个EVs需要具 有两种或两种以上靶标同时表达才能够对肿瘤进行较准确的诊断(NatureCommunications,2019,10,3854)。而这对开发能检测同时表达多种靶标的EVs 亚型的方法提出了挑战。
[0004]目前，对于体液中EVs亚型的检测主要是通过先分离富集捕获，再与多个 荧光标记的靶标抗体/适体作用，荧光显微镜下共定位检测。这些方式需要将 EVs进行分离，耗时长，不方便，易造成EVs的损失和污染，不利于临床常规 开展。基于此，近期本领域开始发展无分离提取的EVs亚型检测方法，如热泳 动富集、逻辑门运算、联合立足放大等方法，这些方法都希望能够实现无分离 提取下对EVs亚型进行检测。然而，由于体液的复杂性，真正能用于临床体液 样品的无分离方法较少，或灵敏度不高，又或者需要借助于数字PCR等昂贵的 仪器才能得到满意的灵敏度。因此，开发出一种简单快速、灵敏度高、价格便 宜、无需分析提取、易于制作成临床检测试剂盒的EVs亚型检测方法在临床诊 断中具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种无分离体系中细胞外囊泡及其亚型的检测方法 和应用，本专利技术提供的检测方法可以实现在无分离体系中基于荧光偏振技术检 测细胞外囊泡，具有操作简单、检测迅速、灵敏度高、不易受荧光强度波动、 荧光漂白的影响等优点。
[0006]为此，第一方面，本专利技术提供一种检测探针，其包括探针Ⅰ、探针Ⅱ和探 针Ⅲ；所述探针Ⅰ的一端标记有生物素，另一端标记有第一识别单元；所述探 针Ⅱ的一端标记有荧光染料；所述探针Ⅲ的一端标记有第二识别单元；
[0007]所述探针Ⅰ与所述探针Ⅱ部分配对，使得所述生物素与所述荧光染料相互 靠近；
在检测靶标存在的条件下，通过联合立足作用，所述探针Ⅰ、所述探针
ꢀⅡ
分别与所述探针Ⅲ部分配对，使得所述探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ杂交形成T 型结构；
[0008]所述第一识别单元特异性识别细胞膜、第一靶标蛋白、第一靶标多糖或第 一靶标脂类；所述第二识别单元特异性识别细胞膜、第二靶标蛋白、第二靶标 多糖或第二靶标脂类。
[0009]进一步，所述第一识别单元为胆固醇、第一核酸适体或第一抗体。
[0010]进一步，所述第二识别单元为胆固醇、第二核酸适体或第二抗体。
[0011]进一步，所述探针Ⅰ、探针Ⅱ、探针Ⅲ为单链核苷酸。
[0012]进一步，所述探针Ⅰ、探针Ⅱ、探针Ⅲ各自独立地选自单链脱氧核糖核苷 酸(ssDNA)、单链核糖核苷酸(ssRNA)、脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的 杂交单链(ssDNA与ssRNA的杂交单链)。
[0013]在一些实施方式中，所述探针Ⅰ、探针Ⅱ、探针Ⅲ为单链脱氧核糖核苷酸。
[0014]进一步，所述探针Ⅰ中，标记有第一识别单元的一端具有第一非配对序列， 所述第一非配对序列无法与所述检测探针中的其他序列进行互补配对。
[0015]进一步，所述探针Ⅲ中，标记有第二识别单元的一端具有第二非配对序列， 所述第二非配对序列无法与所述检测探针中的其他序列进行互补配对。
[0016]进一步，所述第一非配对序列和所述第二非配对序列的长度各自独立地选 自0
‑
80bp，例如1bp、5bp、10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、40bp、 45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp等。
[0017]在一些实施方式中，所述第一非配对序列和所述第二非配对序列各自独立 地选自寡聚胸腺嘧啶核苷酸(寡聚T)、寡聚腺嘌呤核苷酸(寡聚A)、寡聚 胞嘧啶核苷酸(寡聚C)、寡聚鸟嘌呤核苷酸(寡聚G)、寡聚尿嘧啶核苷酸 (寡聚U)。
[0018]根据本专利技术的技术方案，所述探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ杂交形成的T型结 构在没有细胞外囊泡靶标存在时，在检测体系温度条件下不稳定。例如，探针
ꢀⅠ
与探针Ⅱ的部分配对的Tm值、探针Ⅰ与探针Ⅲ的部分配对的Tm值、探针
ꢀⅡ
与探针Ⅲ的部分配对的Tm值均小于检测体系温度；只有当细胞外囊泡靶标 存在的条件下，通过联合立足作用，所述探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ杂交形成的 T型结构在检测体系温度条件下才能稳定存在。在满足此条件的情况下，对探 针Ⅰ与探针Ⅱ的部分配对的序列长度、探针Ⅰ与探针Ⅲ的部分配对的序列长度、 探针Ⅱ与探针Ⅲ的部分配对的序列长度无特别要求。
[0019]在一些实施方式中，所述探针Ⅰ与所述探针Ⅱ的部分配对的序列长度、探 针Ⅰ与探针Ⅲ的部分配对的序列长度、探针Ⅱ与探针Ⅲ的部分配对的序列长度 各自独立地选自5
‑
30bp，例如5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、12bp、 15bp、18bp、20bp，22bp、25bp、28bp、30bp等。
[0020]在某实施例中，所述探针Ⅰ从5
’
端至3
’
端依次包括：生物素、与探针
Ⅱꢀ
配对的序列、与探针Ⅲ配对的序列、可选的第一非配对序列、第一识别单元；
[0021]所述探针Ⅱ从5
’
端至3
’
端依次包括：与探针Ⅲ配对的序列、与探针Ⅰ配 对的序列、荧光染料；
[0022]所述探针Ⅲ从5
’
端至3
’
端依次包括：与探针Ⅰ配对的序列、与探针Ⅱ配 对的序列、可选的第二非配对序列、第二识别单元。
[0023]在另一实施例中，所述探针Ⅰ从3
’
端至5
’
端依次包括：生物素、与探针
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测探针，其特征在于，包括探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ；所述探针Ⅰ的一端标记有生物素，另一端标记有第一识别单元；所述探针Ⅱ的一端标记有荧光染料；所述探针Ⅲ的一端标记有第二识别单元；所述探针Ⅰ与所述探针Ⅱ部分配对，使得所述生物素与所述荧光染料相互靠近；在检测靶标存在的条件下，所述探针Ⅰ、所述探针Ⅱ分别与所述探针Ⅲ部分配对，使得所述探针Ⅰ、探针Ⅱ和探针Ⅲ杂交形成T型结构；所述第一识别单元特异性识别细胞膜、第一靶标蛋白、第一靶标多糖或第一靶标脂类；所述第二识别单元特异性识别细胞膜、第二靶标蛋白、第二靶标多糖或第二靶标脂类。2.如权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述第一识别单元为胆固醇、第一核酸适体或第一抗体；优选地，所述第二识别单元为胆固醇、第二核酸适体或第二抗体。3.如权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述探针Ⅰ中，标记有第一识别单元的一端具有第一非配对序列，所述第一非配对序列无法与所述检测探针中的其他序列进行互补配对；优选地，所述探针Ⅲ中，标记有第二识别单元的一端具有第二非配对序列，所述第二非配对序列无法与所述检测探针中的其他序列进行互补配对；优选地，所述第一非配对序列和所述第二非配对序列的长度各自独立地选自0
‑
80bp；优选地，所述第一非配对序列和所述第二非配对序列各自独立地选自寡聚胸腺嘧啶核苷酸、寡聚腺嘌呤核苷酸、寡聚胞嘧啶核苷酸、寡聚鸟嘌呤核苷酸、寡聚尿嘧啶核苷酸。4.如权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述探针Ⅰ与所述探针Ⅱ的部分配对的序列长度、探针Ⅰ与探针Ⅲ的部分配对的序列长度、探针Ⅱ与探针Ⅲ的部分配对的序列长度各自独立地选自5
‑
30bp。5.一种检测体系，其特征在于，包括权利要求1
‑
4任一项所述的检测探针和缓冲液。6.如权利要求5所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包括链霉亲和素；优选地，所述缓冲液包括PBS缓冲液，Mg
2+
；优选地，所述检测体系中，所述检测探针的浓度为0.5
‑
5nM；优选地，所述检测体系中，所述探针Ⅰ、探针Ⅱ、探针Ⅲ的摩尔比为1
‑
1.2:1
‑
1.2:1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：方晓红，张振，刘维凤，徐丽，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：