基于蛛丝-阳离子多肽融合蛋白的纯化及水下粘附水凝胶的制备方法技术

一种基于蛛丝

Purification of spider silk cationic polypeptide fusion protein and preparation of underwater adhesive hydrogel

【技术实现步骤摘要】
100mg/ml的蛋白溶液。
[0021]所述的交联反应是指：按1：1体积比将高纯度目的蛋白的溶液逐渐滴加到单宁酸溶液中，滴加完毕后使用搅拌棒搅拌，即可形成粘附于搅拌棒的水凝胶。
[0022]本专利技术涉及上述方法制备得到的水下粘附水凝胶，其宏观形态为柔软可塑形的浅棕色固体，微观形态为丰富的孔洞结构，水下粘附强度为1～100kpa。技术效果
[0023]与现有技术相比，本专利技术利用表达宿主本身的负电OmpF蛋白为纯化介质的纯化方式避免了柱层析纯化方式的上料体积限制，耗材昂贵，流程复杂缓慢，难以放大等问题，可将整个纯化流程时间缩短至亲和层析纯化的十分之一，耗材成本极低，操作便捷且可工业批量放大；本专利技术制得的天然多肽修饰的蛛丝融合蛋白对比蛛丝蛋白在同等水凝胶制备和使用条件下展示出更高的粘附性能，且无其他粘附水凝胶中的非天然致毒成分，对组织器官表面和常见材料如塑料，金属等均具有快速，稳定的粘附性。
附图说明
[0024]图1为实施例中蛛丝
‑
阳离子多肽融合蛋白的SDS
‑
PAGE图；
[0025]图中：#1为LL37
‑
MaSpI16蛋白，#2为protamine
‑
MaSpI16蛋白；
[0026]图2为本专利技术中蛛丝
‑
阳离子多肽融合蛋白的纯化流程示意图；
[0027]图3为实施例LL37
‑
MaSpI16蛋白纯化流程的SDS
‑
PAGE图；
[0028]图中：#P0显示LL37
‑
MaSpI16蛋白和OmpF蛋白结合而沉淀实现粗纯，#P1显示 OmpF蛋白被PEI
10kDa
所竞争结合沉淀分离，释放出#S2所示的LL37
‑
MaSpI16蛋白。
[0029]图4为实施例LL37
‑
MaSpI16 TA水凝胶实物照片，TA指代单宁酸；
[0030]图5为实施例LL37
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MaSpI16 TA水凝胶，protamine
‑
MaSpI16 TA水凝胶以及对照 MaSpI16 TA水凝胶的扫描电子显微镜照片，制备水凝胶采用的蛋白浓度为100mg/ml，TA浓度为200mg/ml，两者体积比为1：1；
[0031]图6为实施例LL37
‑
MaSpI16 TA水凝胶，protamine
‑
MaSpI16 TA水凝胶以及对照 MaSpI16 TA水凝胶的流变学实验数据，制备水凝胶采用的蛋白浓度为100mg/ml，TA浓度为 200mg/ml，两者体积比为1：1；
[0032]图中：G
’
为弹性模量，G”为损耗模量；
[0033]图7为实施例LL37
‑
MaSpI16 TA水凝胶，protamine
‑
MaSpI16 TA水凝胶以及对照 MaSpI16 TA水凝胶水下粘附性能测试数据示意图，制备水凝胶采用的蛋白浓度为100mg/ml， TA浓度为100～300mg/ml，两者体积比为1：1；
[0034]图8为蛛丝
‑
阳离子多肽融合蛋白粘附应用示意图。
具体实施方式
[0035]本实施例包括以下步骤：
[0036]步骤1)构建目标蛋白表达载体，将该表达载体导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中实现表达生产的方法，具体包括：
[0037]1.1)将合成的阳离子多肽基因通过限制性核酸内切酶BamHI HF和NcoIHF进行双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接至表达载体pET28a4
‑
MaSpI16上构建得到LL37
‑
MaSpI16融
合蛋白的表达载体和protamine
‑
MaSpI16融合蛋白的表达载体。
[0038]1.2)对于LL37
‑
MaSpI16融合蛋白而言，其表达生产流程为：将表达载体pET28a4
‑ꢀ
LL37
‑
MaSpI16转化入表达宿主细胞后，将该表达宿主细胞在含卡那霉素(50mg/L)的4mL LB 试管培养基中37℃培养6～8h后，接种在4～6个含卡那霉素(50mg/L)的50mL R/2培养基的小摇瓶中37℃培养8h左右之后，将其全部转入含卡那霉素的2L R/2培养基发酵罐中， 37℃培养至OD600为40左右时，加入浓度为1M的IPTG溶液2ml，16℃诱导表达 12～16h后收菌。
[0039]对于protamine
‑
MaSpI16融合蛋白而言，其表达生产流程为：将表达载体pET28a4
‑ꢀ
protamine
‑
MaSpI16转化入表达宿主细胞后，将该表达宿主细胞接种于含卡那霉素(50mg/L) 的4mL LB试管，37℃，220rpm过夜培养。以1％的接种量，将上述菌液转接至100mL 含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养3～4h，至菌液OD600达到 3～4时，将上述菌液全部添加至含卡那霉素(50mg/L)的800ml TB液体培养基中，37℃， 220rpm培养。当OD600达到6～8时诱导表达，添加0.9mL 1M IPTG进行诱导，诱导条件为16℃、220rpm、20h。
[0040]所述的克隆宿主大肠杆菌E.coli DH5α，表达宿主E.coli BL21(DE3)；表达质粒 pET28a4；BamHI&NcoI限制性内切酶，T4 DNA连接酶；卡那霉素，氯霉素；LB培养基， R/2培养基。
[0041]所述的LB培养基(每升)的组分含量为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠，高压蒸汽灭菌121℃，20min。
[0042]所述的TB培养基(每升)的组分含量为：13.4g/L胰蛋白胨，26.7g/L酵母提取物， 5.6g/L甘油以配置组分A，搅拌混匀后每个2L摇瓶中装入720ml组分A，高压蒸汽灭菌 121℃，20min。组分B磷酸盐缓冲液：23.1g/L KH2PO4，164.3g/L K2HPO4
·
3H2O，高压蒸汽灭菌121℃，20min。使用前在每720mL组分A中添加组分B 80mL。
[0043]所述的R/2培养基(每升)的组分含量为：2g/L(NH4)2SO4、6.75g/L KH2PO4、0.85 g/L柠檬酸、Trace metal 5mL/L，该培养基经氢氧化钾调节pH至6.8，高压蒸汽灭菌 121℃，20min。
[0044]步骤2)收获发酵菌体后的分离纯化：把表达有融合蛋白LL37
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MaSpI的大肠杆菌湿菌体以1：10质量体积比充分重悬于BufferA中调节pH至Z，再通过高压匀浆仪高压 800～1000bar压力破本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于蛛丝
‑
阳离子多肽融合蛋白的水下粘附水凝胶的制备方法，其特征在于，将重组蛛丝蛋白基因与阳离子多肽的基因融合后连接至表达载体pET28a4构建得到重组表达载体，然后将重组表达载体导入表达宿主细胞中，经过发酵表达以及分离纯化后得到高纯度目的蛋白；再将高纯度目的蛋白的溶液与单宁酸溶液交联反应得到水下黏附水凝胶；所述的重组蛛丝蛋白基因是指：金丝网蛛(Trichonephila clavipes)牵引丝蛋白MaSpI核心重复序列重复4、8、16、32和64次的蛋白，其中：MaSpI核心重复序列的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的分离纯化，利用重组蛛丝蛋白的正电嵌段和负电的OmpF膜蛋白结合，将pH调节至该结合物的等电点Z使其沉淀粗纯，经漂洗后溶解于Buffer B中，利用Buffer B中PEI的强正电荷结合该负电杂蛋白OmpF使其沉淀，而重组蛛丝蛋白仍存在于上清中实现了进一步纯化。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的构建是指：将合成的阳离子多肽基因通过限制性核酸内切酶BamHI HF和NcoIHF进行双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接至表达载体pET28a4得到重组蛛丝蛋白的表达载体。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，所述的阳离子多肽包括：LL37、protamine多肽、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚组氨酸、富含赖氨酸、富含精氨酸、富含组氨酸等的带正电荷多肽。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述的LL37的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，即：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，其密码子优化过后的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，即：5
’‑
CTGCTGGGCGATTTCTTCCGCAAAAGCAAAGAAAAAATCGGCAAAGAATTCAAACGCATCGTTCAGCGCATCAAAGATTTCCTGCGCAATCTGGTTCCGCGCACCGAAAGC
‑3’
；所述的protamine多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，即：RSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRS(来自数据库：NCBI)，其密码子优化过后的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，即：5
’‑
CGTAGCCAGAGCCGTAGCCGTTACTACCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱志刚，刘树安，黄盛晨，夏小霞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：