一种重组TetR蛋白及其制备方法和试剂盒以及牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种重组TetR蛋白及其制备方法和试剂盒以及牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法，属于动物性食品安全技术领域。本发明专利技术提供您的重组TetR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该重组TetR蛋白与四环素类药物具有良好的亲和力，在检测四环素类药物时具有很高的灵敏性，能够用于畜禽产品中四环素、金霉素、土霉素、米诺环素等四环素类药物的残留检测。本发明专利技术提供的牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法为直接竞争化学发光检测法，可以用于牛奶中四环素类药物残留快速分析，能够提高检测效率、缩短检测时间、降低检测成本。降低检测成本。降低检测成本。

A recombinant TetR protein, its preparation method and kit, and a method for detecting tetracycline antibiotic residues in milk

【技术实现步骤摘要】
TEKQYETLEN QLAFLCQQGF SLENALYALS AVEHFTLGCV LEDQEHQVAK EERETPTTDS MPPLLRQAIE LFDHQGAEPA FLFGLELIIC GLEKQLKCES KLAAALEHHH HHH。
[0010]以及，本专利技术实施例还提供上述重组TetR蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0011]S1、将pET
‑
32a
‑
tetR质粒作为模板，以序列为5
′‑
CGGGATCCATGTCTAGATTAGATAAAAGT
‑3′
和5
′‑
CCCAAGCTTTTAACTTTCCATTTAAGT
‑3′
的引物进行SOE
‑
PCR扩增，获得突变的pET
‑
32a
‑
tetR
’
质粒；所述突变的pET
‑
32a
‑
tetR
’
质粒的tetR
’
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012]S2、对S1所得突变的pET
‑
32a
‑
tetR
’
质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组表达菌；将所述重组表达菌在LB培养液中进行培养，并在培养过程中以异丙基硫代半乳糖苷诱导；离心，收集沉淀；
[0013]S3、向所述沉淀中加入细菌裂解液，超声破碎后离心，收集上清液，向所述上清液中加入结合缓冲液，用琼脂糖凝胶纯化蛋白，即得。
[0014]该方法根据TetR蛋白的基因序列，利用基因克隆、构建重组质粒、原核表达等方法，能够获得上述重组TetR蛋白。
[0015]优选地，S1中所述SOE
‑
PCR扩增的反应体系为：
[0016][0017]扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，25个循环；72℃延伸5min。
[0018]优选地，所述结合缓冲液按以下方法配制而成：1M Tris
‑
HCl 4mL，1M咪唑缓冲液100mL，3M NaCl 33.33mL，超纯水定容至200mL。
[0019]优选地，所述LB培养液中含有50μL/mL氨苄青霉素。
[0020]优选地，S2中在LB培养液中培养所述重组表达菌的条件为37℃、200转/min震荡培养2h。加入0.5mM IPTG后，继续震荡培养2h，4000转/min离心10min收集沉淀。
[0021]优选地，S3中超声破碎20min，4℃、12000转/min离心10min，收集上清液。
[0022]优选地，S3中所述上清液与所述结合缓冲液的体积比为1：1。
[0023]优选地，琼脂糖凝胶可选用Ni
‑
Agarose Resin。
[0024]以及，本专利技术实施例还提供一种检测四环素类抗生素残留的试剂盒，所述试剂盒包括上述重组TetR蛋白。
[0025]优选地，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记四环素半抗原，鲁米诺，4
‑
(咪唑
‑1‑
基)苯酚和双氧水。以上试剂均可选择用于检测分析的市售试剂。
[0026]以上述重组TetR蛋白作为核心元件，结合辣根过氧化物酶标记四环素半抗原，以鲁米诺、4
‑
(咪唑
‑1‑
基)苯酚、双氧水作为化学发光试剂，可以通过直接竞争化学发光检测方法对牛奶等畜禽产品中四环素类药物残留进行高通量、快速、有效的检测。
[0027]其中所述辣根过氧化物酶标记四环素半抗原的合成方法为：在正丁胺条件下，用10μL氯甲酸异丁酯(正丁胺与氯甲酸异丁酯的体积比为5.4～6.6：4，v/v)活化5mg四环素半抗原中的羧基，再与2mL的5mg/mL辣根过氧化物酶溶液反应8
‑
12h；使用时稀释1000倍。
[0028]以及，本专利技术实施例还提供了一种牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法，包括以下操作：
[0029]用上述重组TetR蛋白包被微孔板，向所述微孔板的微孔中依次加入辣根过氧化物酶标记四环素半抗原溶液、待测样品溶液，孵育后洗净，加入鲁米诺的乙腈溶液，4
‑
(咪唑
‑1‑
基)苯酚的水溶液和双氧水稀释液，用酶标仪检测。
[0030]该检测方法为化学发光免疫分析法，通过酶联免疫与化学发光相结合以实现高灵敏性。鲁米诺在碱性条件下可以被催化氧化并同时发光，通过结合其他反应试剂，可以获得良好的化学发光信号，并能够用于待测样品中痕量四环素类药物的检测。
[0031]该方法中鲁米诺的乙腈溶液，4
‑
(咪唑
‑1‑
基)苯酚的水溶液和双氧水稀释液均为化学发光试剂，三者体积比为1:(0.95～1.05):(0.95～1.05)，优选采用1:1:1。
[0032]优选地，所述鲁米诺的乙腈溶液中鲁米诺的浓度为0.84～0.92g/L，优选采用0.88g/L；所述4
‑
(咪唑
‑1‑
基)苯酚的水溶液中4
‑
(咪唑
‑1‑
基)苯酚的浓度为0.15～0.17g/L，优选采用0.16g/L；所述双氧水稀释液中过氧化氢的浓度为0.095～0.105mL/L，优选采用0.1mL/L。
[0033]以上化学发光试剂可采用以下方法制备得到：
[0034]将0.84～0.92g鲁米诺用1mM的NaOH溶解后用乙腈定容至100mL，得鲁米诺的乙腈溶液；
[0035]将0.15～0.17g 4
‑
(咪唑
‑1‑
基)苯酚用DMF溶解后用水定容至100mL，得4
‑
(咪唑
‑1‑
基)苯酚的水溶液；
[0036]将0.095～0.105mL过氧化氢加入蒸馏水中，定容至1L，得双氧水稀释液。
[0037]优选地，用上述重组TetR蛋白包被微孔板可采用以下方法：
[0038]第一步、用所述重组TetR蛋白水溶液作为包被液加入96孔板中，4℃，孵育12～14h，弃包被液；
[0039]第二步、用磷酸盐缓冲液(PBST，pH7.5)清洗、控干，重复三～四次；
[0040]第三步、加入封闭液于37℃，湿度60％
±
5％，孵育50～70min；其中封闭液可选用2％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液溶液。
[0041]经上述方法包被后，包被量约为0.02μg/孔。
[0042]优选地，所述磷酸盐缓冲液中含有0.05％v/v吐温。
[0043]本专利技术的有益效果在于：
[0044]本专利技术对天然TetR蛋白第103位和112位氨基酸的编码基因突变改造获得重组载体pET...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组TetR蛋白，其特征在于，所述重组TetR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的重组TetR蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1、将pET
‑
32a
‑
tetR质粒作为模板，以序列为5
′‑
CGGGATCCATGTCTAGATTAGATAAAAGT
‑3′
和5
′‑
CCCAAGCTTTTAACTTTCCATTTAAGT
‑3′
的引物进行SOE
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PCR扩增，获得突变的pET
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32a
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tetR
’
质粒；所述突变的pET
‑
32a
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tetR
’
质粒的tetR
’
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；S2、对S1所得突变的pET
‑
32a
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tetR
’
质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组表达菌；将所述重组表达菌在LB培养液中进行培养，并在培养过程中以异丙基硫代半乳糖苷诱导；离心，收集沉淀；S3、向所述沉淀中加入细菌裂解液，超声破碎后离心，收集上清液，向所述上清液中加入结合缓冲液，用琼脂糖凝胶纯化蛋白，即得。3.根据权利要求2所述的重组TetR蛋白的制备方法，其特征在于，S1中所述SOE
‑
PCR扩增的反应体系为：增的反应体系为：扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，25个循环；72℃延伸5min。4.根据权利要求2所述的重组TetR蛋白的制备方法，其特征在于，所述结合缓冲液按以下方法配制而成：1M Tris
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HCl 4mL，1M咪唑...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘静，王建平，王鸽，夏婉秋，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：