毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法技术

本发明专利技术公开了毛发中褪黑素、N

Simultaneous extraction and detection of melatonin, N-acetylserotonin, 6-hydroxymelatonin, cortisol and cortisone in hair

【技术实现步骤摘要】
毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法


[0001]本专利技术涉及化合物的提取和检测方法，特别涉及毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法。

技术介绍

[0002]睡眠是人体重要的生理过程，长期睡眠状况对人的身体和精神健康都有着重大影响。褪黑素和皮质醇是能够调节人体的睡眠、生物节律、免疫等多种生理功能的激素，并且它们的内源性分泌均遵从昼夜节律。松果体分泌的褪黑素呈现白天分泌少、夜间分泌多的规律，午夜时分在人类体内循环系统中的浓度最高；皮质醇则是夜间分泌极少，晨醒后半小时分泌达到峰值，而后逐渐下降。褪黑素和皮质醇与睡眠之间存在紧密关联，可作为睡眠状态的生物标志物。然而，褪黑素和皮质醇在人体内易快速代谢，这导致这两者具有含量低，且个体间差异巨大的缺陷。由于6
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羟基褪黑素、N
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乙酰血清素及可的松分别作为褪黑素和皮质醇的主要代谢物，其含量相对稳定，个体差异较小，且在人体内的分泌和它们的前体一样存在昼夜节律性，因此也有可能成为睡眠状态的生物标志物，弥补褪黑素和皮质醇的局限性。
[0003]在实际应用中，广泛地采用血清、血浆、唾液或尿液作为生物基质进行褪黑素、皮质醇及其代谢物的检测，但这些基质也有一定的局限性。其中血液中的激素含量波动大，容易受到环境因素干扰，且采集血样的过程有可能引起受试者应激，使结果不可靠；唾液和尿液则可以避免应激，但二者与血液同样为流体基质，有着即时性强的特点，都只能反映某个时间点的激素水平或过去较短时间段内的激素总量。如果希望通过此类基质反映长期状况，就需要对受试者进行长期的连续重复采样，过程繁琐、操作复杂。
[0004]相较于流体基质，毛发作为固体基质，其中的激素含量更稳定，更能反映激素的长期累积水平，而且毛发样本采集简便、保存要求低、生长速度均匀，便于匹配发段位置和期待的时间窗口。毛发中的内源性物质主要来源于血液中游离物质的被动扩散，所反映的是血液中游离的内源性物质的长期水平。
[0005]当前检测褪黑素、皮质醇及他们的代谢物的主要手段有免疫法、高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法。免疫法虽然灵敏度高且经济便捷，但可能发生交叉反应影响结果，而且不能同时检测多种物质。高效液相色谱法常与紫外或荧光检测器联用，但此种方法往往需要预先进行富集和衍生化，操作复杂。考虑到毛发中的物质含量远低于流体基质，灵敏度高、特异性好的高效液相色谱串联质谱法或许更适合。此外，褪黑素及其代谢物的热稳定性相对较低。在以前单独分析头发皮质醇的样本提取中孵育温度往往较高，多在40度以上，以前的提取方法可能不适合褪黑素及其代谢物的提取。因此，本专利技术旨在建立一种同时提取和检测毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松的液相色谱串联质谱法。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：本专利技术提供一种灵敏度高、特异性好、准确可靠的，基于高效液相色谱串联质谱技术的涉及毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法。
[0007]技术方案：本专利技术的毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法包括以下步骤：
[0008](1)采集人体毛发样本并预处理；
[0009](2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
[0010](3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物含量的检测。
[0011]进一步地，所述步骤(1)中预处理的步骤为：将采集得到的毛发样本，在室温下加入小分子有机溶剂进行清洗。清洗所使用的小分子有机溶剂为甲醇。所述步骤(2) 中孵育、萃取的步骤为：向预处理后的头发碎段中加入孵育溶剂孵育12～36h，再将孵化后的溶液离心，取上清液，在氮气流下蒸发后，再重新用流动相溶液溶解。孵育温度和氮气流蒸发温度均为20～30℃。孵育溶剂由50μL的含2.5～10ng内标物的内标溶液和950uL的甲醇构成，内标物为四氘代褪黑素、四氘代N
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乙酰血清素、四氘代6
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羟基褪黑素、二氘代皮质醇或八氘代可的松。所述步骤(3)中目标物含量的检测步骤为：重溶液经高效液相色谱串联质谱仪分离后，通过质谱仪进行检测，并由内标法定量。
[0012]高效液相色谱串联质谱仪的色谱分离条件包括如下：
[0013](1)色谱柱：C18色谱柱；
[0014](2)流动相：甲醇和水的体积比为95∶5，其中每100mL流动相中含约0.0019g乙酸铵，溶液配制后用0.22μm微孔滤膜过滤，并进行15min的超声脱气处理；
[0015](3)流速：200μL/min；
[0016](4)进样量：10μL。
[0017]高效液相色谱串联质谱仪的质谱检测条件包括如下：
[0018](1)离子模式：正离子模式；
[0019](2)离子化方法：电喷雾；
[0020](3)离子化参数：电喷雾电压，5500伏特；离子源温度，450℃；雾化气压，20psi；卷帘气压，20psi；碰撞气压，Medium；驻留时间，100ms；
[0021](4)监测模式：多反应监测模式。
[0022]高效液相色谱串联质谱仪的定量方法为内标法，内标法所用标准曲线包括如下：
[0023](1)头发空白基质：远离头皮12厘米的发梢，或连续在甲醇中浸泡7天以上的发根，其中的褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松含量低于本方法的检测限；
[0024](2)标准曲线纵坐标：标准品的峰面积与相对应氘化物的峰面积比值；
[0025](3)标准品：褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松的同时提取和检测方法；
[0026](4)氘化内标：四氘代褪黑素、四氘代N
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乙酰血清素、四氘代6
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羟基褪黑素、二氘代皮质醇和八氘代可的松。
[0027]作为优选方案：
[0028](1)采集人体毛发样本并预处理；
[0029]将采集得到的毛发样本，在室温下加入2mL小分子有机溶剂进行清洗，共振摇清洗2次，每次2min，清洗后发样在50℃下风干，再用洁净的剪刀剪为1mm左右的碎段；
[0030](2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
[0031]向头发碎段中加入孵育溶剂孵育12～36h，再将孵化后的溶液用离心机以12000转/ 分钟的速度离心5min，取上清液，取得的上清液在氮气流下蒸发后，再重新用50μL 的流动相溶液溶解，其中孵育温度和氮气流蒸发温度均为室温(20～30℃)，孵育溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采集人体毛发样本并预处理；(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物含量的检测。2.根据权利要求1所述的毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中预处理的步骤为：将采集得到的毛发样本，在室温下加入小分子有机溶剂进行清洗。3.根据权利要求2所述的毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：清洗所使用的小分子有机溶剂为甲醇。4.根据权利要求1所述的毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中孵育、萃取的步骤为：向预处理后的头发碎段中加入孵育溶剂孵育12～36h，再将孵化后的溶液离心，取上清液，在氮气流下蒸发后，再重新用流动相溶液溶解。5.根据权利要求4所述的毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：孵育温度和氮气流蒸发温度均为20～30℃。6.根据权利要求4所述的毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：孵育溶剂由50μL的含2.5～10ng内标物的内标溶液和950μL的甲醇构成，内标物为四氘代褪黑素、四氘代N
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乙酰血清素、四氘代6
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羟基褪黑素、二氘代皮质醇或八氘代可的松。7.根据权利要求1所述的毛发中褪黑素、N
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乙酰血清素、6
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羟基褪黑素、皮质醇和可的松的...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓慧华，朱敏惠，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：