一种同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，步骤包括：(1)采集人体头发样本并清洗；(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物的含量检测。本发明专利技术基于高效液相色谱串联电喷雾离子化源质谱，建立了一种同时提取和检测头发基质中甲状腺素(T4)、3，3

A method for simultaneous extraction and detection of thyroid hormone and steroid hormone in hair

【技术实现步骤摘要】
一种同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法


[0001]本专利技术涉及化合物的提取和检测方法，特别涉及一种同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法。

技术介绍

[0002]甲状腺激素是人体重要的内分泌激素，甲状腺激素的主要功能是控制机体的整体代谢、免疫调节、蛋白质合成、碳水化合物和脂肪代谢、神经发育、骨骼的正常生长和成熟，以及心血管和肾脏功能。甲状腺激素的合成由下丘脑
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垂体
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甲状腺(HPT)轴调节，甲状腺素(T4)和3，3
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，5
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三碘甲状腺原氨酸(T3)是两种最主要的碘甲状腺激素，但它们很容易通过多种代谢途径被快速降解为活性和非活性代谢物。其中，脱碘化是主要途径。T4通过不同的碘甲状腺素脱碘酶形成多种代谢物，包括3，3
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，5
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三碘甲状腺原氨酸(rT3)、3，3
′‑
二碘甲状腺原氨酸(3，3
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T2)和L
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甲状腺原氨酸(T0)。检测甲状腺激素及其代谢物的含量有助于更全面、准确地评估HPT轴的功能活性。
[0003]皮质醇是人体内重要的糖皮质激素，负责调节情绪、维持免疫细胞和炎症、血管和血压等生理功能。皮质醇是下丘脑
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垂体
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肾上腺(HPA)轴的终端产物，但是当血液中皮质醇的含量过高时，又会通过负反馈作用抑制下丘脑和垂体，以此降低皮质醇的水平。此外，皮质醇在2型11β
‑<br/>羟化类固醇脱氢酶(11β
‑
HSD2)的作用下可以转化成可的松(E)。因此，皮质醇和可的松的含量可以作为评价HPA功能活性的生物标志物。
[0004]皮质醇能够抑制急性应激诱导的免疫反应，发挥其抗炎特性。然而，当人体长期处于慢性压力时，HPA轴被持续激活，导致压力反应通路的失调，加剧炎症反应。有研究表明，皮质醇可以在下丘脑和垂体层面抑制HPT轴，降低促甲状腺激素释放激素(TRH)和促甲状腺激素(TSH)释放，从而抑制甲状腺激素的分泌。此外，皮质醇也会抑制负责将T4转化为T3的2型脱碘酶的活性，导致甲状腺功能减退。由此可见，HPA轴与HPT轴之间有着密切的相互作用。开发同时检测人体内的甲状腺激素和皮质醇含量的方法非常有必要，这有助于进一步探索HPT与HPA轴的作用机制，以及它们之间相互作用的病理生理学机制，从而应用于临床疾病的辅助诊断和健康管理。
[0005]在实际应用中，广泛地采用血浆、血清、唾液或尿液作为生物基质进行甲状腺激素、皮质醇和可的松的检测，但这些基质也有一定的局限性。第一，传统生物基质都有较强的即时性，只能反映某个时间点或短期内的激素总量。如果希望通过此类基质反映长期状况，就需要对受试者进行长期的连续重复采样，过程繁琐、操作复杂。第二，血液中的激素含量波动大，容易受到环境因素干扰，且采集血样的过程有可能引起受试者应激，使结果不可靠。第三，传统生物基质的保存要求较高，从采集到最终检测期间，样本都必须保存在低温环境中。第四，目前的临床实践是以游离激素的浓度为导向，但血清或唾液中的游离态的甲状腺激素含量较低，为pg/mL水平。例如，甲状腺中游离激素的含量保持不变，而激素总量随着载体蛋白的浓度而变化。若采用传统生物基质，游离组分的定量检测需要在质谱分析之前进行样品预处理，以除去与蛋白质结合的激素。
[0006]相比之下，头发基质具有很多优势。第一，头发中的激素浓度具有累积性和可回溯性，人脑后枕部头发平均生长速度约为1cm/月，可以反映最近一个月中体内激素水平的累积情况，适用于长期激素水平分析。第二，头发样本的采集无创伤性，被试更易于接受，且头发本身结构比较稳定，保存要求低，常温下置于锡箔纸或信封中可长期保存。第三，头发中的内源性物质主要来源于血液中游离物质的被动扩散，所反映的是血液中游离的内源性物质的长期水平。
[0007]传统的检测方法包括免疫法、气相色谱串联质谱法和高效液相色谱串联质谱法。免疫法虽然灵敏度高且经济便捷，但可能发生交叉反应影响结果，而且不能同时检测多种物质。
[0008]高效气相色谱法要求待测物拥有良好的热稳定性和易挥发性，否则就需要先进行衍生化，再经提纯、富集后进行检测，操作复杂。此外，待测物的衍生化会造成待测物的损失，这对原本在头发中含量较低的THs的检测极为不利。
[0009]为实现上述目标物的定量检测，研究者在不断改进现有的方法。已有研究通过高效液相色谱串联质谱法分别建立了检测血清中的甲状腺激素、皮质醇和可的松的定量分析方法，这些方法无法同时检测五种甲状腺激素和两种类固醇激素，而且头发前处理和提取过程操作繁琐，头发样本用量高，不适合于头发样本分析的大规模应用。因此，本专利技术旨在建立一种同时提取和检测头发中甲状腺素、3，3
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，5
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三碘甲状腺原氨酸、3，3
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，5
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三碘甲状腺原氨酸、3，3
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二碘甲状腺原氨酸、L
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甲状腺原氨酸、皮质醇和可的松的高效液相色谱串联质谱法。
[0010]至今，尚未有研究报道同时检测头发基质中五种甲状腺激素和两种类固醇激素的高效液相色谱串联质谱法。大多数研究集中于对两类激素的单独检测，这主要因为现有检测方法存在以下问题。第一，两类激素的溶解度存在较大差异。甲状腺激素微溶于甲醇等有机溶剂，而溶于含有无机酸或碱的甲醇；皮质醇和可的松溶于甲醇，但在碱性条件下不稳定。第二，两类激素的极性有一定的差异，对检测条件的要求各不相同。皮质醇和可的松的极性较弱，流动相多采用高有机相；甲状腺激素及其代谢物的极性较强，且随着代谢途径的延伸，流动相对水相的比例要求逐渐上升。这两方面的差异就对溶剂和流动相的选择提出了挑战。第三，由于头发中游离甲状腺激素含量较少，头发样本前处理和两类激素的同时提取是检测技术的关键。

技术实现思路

[0011]专利技术目的：本专利技术提供一种基于高效液相色谱串联电喷雾离子化源质谱的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，灵敏度高、特异性好。
[0012]技术方案：本专利技术所述的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，包括以下步骤：
[0013](1)采集人体头发样本并预处理；
[0014](2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
[0015](3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物含量的检测。
[0016]作为优选方案：
[0017](1)采集人体头发样本并预处理；
[0018]将采集得到的头发样本，在室温下加入2mL甲醇、异丙醇、丙酮或它们的混合溶液等小分子有机溶剂进行清洗，共振摇清洗2次，每次2min，清洗后发样在50℃下风干，再用洁净的剪刀剪为1mm左右的碎段；
[0019](2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
[0020]向头发碎段中加入孵育溶剂孵育12
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采集人体头发样本并预处理；(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物含量的检测。2.根据权利要求1所述的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，其特征在于：预处理方法：将采集得到的毛发样本，在室温下加入小分子有机溶剂进行清洗；清洗所用的清洗剂为甲醇、异丙醇或丙酮中的一种或几种的混合溶液。3.根据权利要求2所述的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，其特征在于：清洗头发样本后，风干，剪成碎段。4.根据权利要求1或3所述的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，其特征在于：孵育和萃取的步骤为：向头发碎段中加入含甲醇/纯氨水的混合溶液的孵育溶剂孵育12
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36h，再将孵化后的溶液离心，上清液在氮气流下蒸发后，再重新用含甲醇/纯氨水的混合溶液的定溶溶剂溶解。5.根据权利要求4所述的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，其特征在于：孵育溶剂由50μL的含50ng内标物的内标溶液和950μL的含有氨水的高有机相的甲醇/纯氨水(75/25～99/1，v/v)混合溶液构成。6.根据权利要求5所述的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，其特征在于：内标物为甲状腺素
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C6](T4
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C6)、3，3
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三碘甲状腺原氨酸
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C6](T3
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C6)、3，3
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，5
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三碘甲状腺原氨酸
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C6](rT3
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C6)和3，3
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二碘甲状腺原氨酸
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C6](3，3
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T2
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C6)、二氘代皮质醇(F
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d2)或八氘代可的松(E
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d8)。7.根据权利要求1所述的同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中目标物检测的步骤为：重溶液经高效液相色谱分离后，通过高效液相色谱串联质谱仪进行检测，并由内标法定量。8.根据权利要求7所述的同时提取和检测头发中...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓慧华，袁琳，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：