从粪便提取肠上皮细胞DNA的方法技术

本发明专利技术涉及从粪便提取肠上皮细胞特定DNA的方法。具体公开了一种从粪便提取肠上皮细胞特定DNA的方法包括步骤：(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含DNA的混合物，(2)将混合物与PVPP接触，获得去除抑制剂的DNA。本发明专利技术所述方法具有重复好，操作简单，不需要特殊仪器设备等优点。备等优点。

Method of extracting DNA from intestinal epithelial cells from feces

【技术实现步骤摘要】
从粪便提取肠上皮细胞DNA的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
具体地属于分离提取核酸有关的技术，涉及一种粪便提取人细胞特定DNA方法。

技术介绍

[0002]结直肠癌(CRC,肠癌)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,对男性和女性均有影响。随着人们生活习惯的改变,其发病率和死亡率均明显上升。早期肠癌患者手术5年生存率达90％以上,而中晚期患者5年生存率仅10％左右。越早被发现，肠癌就越容易治疗。因此，早发现，早诊断，早治疗对肠癌显得尤为重要。
[0003]目前，传统的肠癌检测方法有多种，但均存在不足。(1)粪便隐血检测(FOBT/FIT):临床常用，检测简便，成本低，受检者可自行取样，但灵敏度和特异性较低。(2)CT检查：对早期以及小直径病灶检出率有限，且存在辐射。(3)肠镜检查：肠癌诊断的金标准，但侵入性强，患者依从性低，有肠穿孔和麻醉风险。
[0004]近年来，基因诊断在人类多种肿瘤、疾病的早诊、治疗以及预后评估中受到广泛重视。其中对肠癌相关基因的研究，使得通过粪便DNA检测辅助诊断结直肠癌成为一种可能。
[0005]肠道上皮细胞3
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4天更新一次，普通人每天大约有10
10
个上皮细胞从肠壁脱落随粪便排出。在肠道肿瘤形成过程中，肿瘤细胞可一起流入结肠随粪便排出，而且肿瘤细胞比正常细胞生长快粘附力差、更易脱落。
[0006]进入粪便的脱落细胞中含有相应的DNA，包含与肿瘤密切相关的遗传信息(如基因突变，甲基化等)，为结直肠癌早期检测提供了稳定的物质基础。通过检测这些DNA标记物，就可以发现结直肠癌或肿瘤等在肠壁的存在，可以对肠道的健康状况进行评估。粪便DNA检测作为一种新兴的肠癌无创筛查，其灵敏性和特异性均优于单独粪便FIT潜血检测，更是一种无创、无痛，用户依从性好的筛查方式。
[0007]成功实施粪便脱落细胞肠癌相关基因检测的重要前提条件是：必需从粪便提取高质量的肠上皮细胞DNA。从肠道内壁脱落的细胞只占粪便中很小的一部分，提取得到的肠道上皮细胞DNA含量少。许多有价值的遗传标记在样本中的含量极低，传统方法和试剂盒主要设计用于从小样本制备DNA，质量多小于1克的样本。因无法从大样本中制备足够数量的高浓度DNA，不适用于高灵敏度和高特异性对人肠道脱离细胞做基因分析。此外，传统技术不能有效去除抑制剂。粪便中含有的大量PCR抑制性物质，如多糖、血红素化合物和胆盐。而且由于粪便中含有很多的细菌，核酸内切酶，导致样品DNA容易降解，所以采集的粪便样品保存方法及保存液亦起着非常关键的作用。传统方法和试剂盒的保存方法多需要低温处理，即冷冻保存。
[0008]为实现稳定可靠的肠癌基因分子诊断，需要解决如何优先从粪便中提取足量且无抑制剂的肠道上皮细胞DNA技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术针对目前粪便DNA提取存在的不足之处，提供一种快速简便、低成本、可靠的人粪便特异性目标DNA提取方法。
[0010]本专利技术第一方面提供一种从粪便样品中富集细胞DNA的非诊断方法，包括步骤：
[0011](1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含DNA的混合物，
[0012](2)将混合物与PVPP接触，获得去除抑制剂的DNA，
[0013]任选的(3)将DNA与离液盐接触。
[0014]在一个或多个实施方案中，所述细胞是肠上皮细胞。
[0015]在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育是冷冻孵育，例如
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30℃至0℃，优选
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20℃至
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10℃。
[0016]在一个或多个实施方案中，细胞裂解液包含EDTA、Tris、碱金属盐，任选还包含抗生素。EDTA的浓度为0.1
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5M，优选0.1
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1M。Tris的浓度为0.05
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5M，优选0.1
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1M。碱金属盐的浓度为1
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200mM，优选1
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50mM。抗生素包括氨苄青霉素和/或链霉素。碱金属盐包括氯化钠、氯化钾或氯化锂，优选氯化钠。
[0017]在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：将粪便样品与细胞裂解液以2％
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50％(g/ml)混匀，冷冻孵育2
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24小时，解冻后混匀。
[0018]在一个或多个实施方案中，粪便样品与细胞裂解液的比例优选10
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30％，更优选约20％。
[0019]在一个或多个实施方案中，步骤(1)还包括固液分离获得上清的步骤。
[0020]在一个或多个实施方案中，冷冻孵育5
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18小时，优选10
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15小时。
[0021]在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：在含DNA的混合物(上清)中加入终浓度1
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20％(g/ml)的PVPP后孵育。所述孵育优选搅拌孵育，例如10
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2000rpm，优选200
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600rpm搅拌。所述孵育的时间优选5
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60min，优选10
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30min。PVPP的终浓度优选2
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10％，更优选约5％。
[0022]在一个或多个实施方案中，步骤(2)还包括固液分离从而移除PVPP的步骤。去除抑制剂的DNA在液体中。
[0023]在一个或多个实施方案中，离液盐是异硫氰酸胍，其在液体中的终浓度为1.0
‑
5.0M，优选2.0
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3.0M。
[0024]本专利技术第二方面提供一种从粪便样品中分离或检测靶DNA的非诊断方法，包括步骤：
[0025](1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含DNA的混合物，
[0026](2)将混合物与PVPP接触，获得去除抑制剂的DNA，
[0027]任选的(3)将DNA与离液盐接触，
[0028](4)使针对靶DNA的寡核苷酸捕获探针在核酸杂交的条件下与所述DNA接触，
[0029](5)分离或检测寡核苷酸捕获探针或由其捕获的DNA，从而分离或检测靶DNA。
[0030]在一个或多个实施方案中，细胞裂解液包含EDTA、Tris、碱金属盐，任选还包含抗生素。EDTA的浓度为0.1
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5M，优选0.1
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1M。Tris的浓度为0.05
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5M，优选0.1
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1M。碱金属盐的浓度为1
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200mM，优选1
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50mM。抗生素包括氨苄青霉素和/或链霉素。碱金属盐包括氯化钠、氯化钾或氯化锂，优选氯化钠。
[0031]在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育是冷冻孵育，例如
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30℃至0℃，优选
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20
℃至
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10℃。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从粪便样品中富集肠上皮细胞DNA的方法，包括步骤：(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含DNA的混合物，(2)将混合物与PVPP接触，获得去除抑制剂的DNA，任选的(3)将DNA与离液盐接触，优选地，步骤(2)包括：在含DNA的混合物中加入终浓度1
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20％(g/ml)的PVPP并孵育，更优选地，PVPP的终浓度为2
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10％，更优选约5％。2.如权利要求1中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)的孵育是冷冻孵育，优选冷冻孵育5
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18小时，和/或细胞裂解液包含EDTA、Tris、碱金属盐，任选还包含抗生素，和/或粪便样品与细胞裂解液的比例为10
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30％，和/或离液盐是异硫氰酸胍，其在液体中的终浓度为1.0
‑
5.0M，优选2.0
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3.0M。3.一种从粪便样品中分离或检测靶DNA的非诊断方法，包括步骤：(1)将粪便样品与细胞裂解液孵育，获得含DNA的混合物，(2)将混合物与PVPP接触，获得去除抑制剂的DNA，任选的(3)将DNA与离液盐接触，(4)使针对靶DNA的寡核苷酸捕获探针在核酸杂交的条件下与所述DNA接触，(5)分离或检测寡核苷酸捕获探针或由其捕获的DNA，从而分离或检测靶DNA，优选地，步骤(2)包括：在含DNA的混合物中加入终浓度1
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20％(g/ml)的PVPP并孵育，更优选地，PVPP的终浓度为2
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10％，更优选约5％。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，细胞裂解液包含EDTA、Tris、碱金属盐，任选还包含抗生素，和/或步骤(1)的孵育是冷冻孵育，优选冷冻孵育5
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18小时，和/或粪便样品与细胞裂解液的比例为10
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30％，优选约20％，和/或离液盐是异硫氰酸胍，其在反应液中的终浓度为5
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50％，优选20
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40％。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述靶DNA是包含SEPT9、SDC2或ACTB基因的DNA片段，和/或所述寡核苷酸捕获探针包含SEQ ID NO:1
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3中任一所示的序列，和/或步骤(5)中的检测靶DNA是对靶DNA进行甲基化检测。6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸捕获探针包含标记部分，例如生物素，和/或步骤(5)包括：使用结合剂选择性捕获靶DNA，所述结合剂与所述寡核苷酸捕获探针的标记部分选择性结合；优选地，所述结合剂是与生物素选择性结合的试剂，例如亲和素或链霉亲和素，和/或所述结合剂与固相载体偶联，从而通过物理或化学过程纯化靶DNA，和/或所述方法还包括使用洗脱液从固相载体上洗脱DNA的步骤。7.PVPP，或PVPP和寡核苷酸捕获探针在制备用于从粪便样品中富集肠癌肿瘤细胞DNA，或分离或检测肠癌肿瘤细胞中靶DNA的试剂盒中的用途，其中，在粪便样品经细胞裂解液处理后，将获得的含DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖国伟，龚伟伟，
申请(专利权)人：上海长岛抗体诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：